Двери ламельные: Дверка жалюзийная 2013х494х20 мм хвоя сорт А

^# Внесено поровну.

Поступила 20.05.2020 г .; Принято 4 декабря 2020 г.

Дополнительные материалы

Дополнительная информация

GUID: 05908EA6-B387-4961-AFB9-EFEAE1374071

Описания дополнительных дополнительных файлов

GUID: 9F7A54E5-4FDEEA3-

GUID: 9F7A54E5-4FDEE-4FDEA-9B9C-9482000 GUID-9 : 65E72FA3-8C0E-4A82-9794-BA092D540D43

Дополнительный фильм 2

GUID: ABF4CFF2-9CFD-41A6-A139-51632190B8A7

Дополнительный фильм 3

-94710: 977C2000 Дополнительные данные GUID40004 977C20003

-94710: 977C20002 1

GUID: C133834E-7D3F-4F52-A980-A3C44081C802

Сводка отчетов

GUID: 0A2C0204-795A-482E-B03D-BAAC658BD8F7

Данные

доступны в базе данных EM под номерами доступа: EMD-10818, EMD-10819, EMD-10820, EMD-10821, EMD-11929 и EMD-11931.Исходные данные предоставлены вместе с этой статьей.

Abstract

Пластинчатые тельца (LB) — это органеллы, богатые сурфактантами, в альвеолярных клетках. LB распадаются на липидно-белковую сеть, которая снижает поверхностное натяжение и облегчает газообмен в альвеолярной полости. Текущие знания об архитектуре LB в основном основаны на исследованиях электронной микроскопии с использованием разрушающих методов пробоподготовки. Мы установили и подтвердили пост-корреляционный метод криокорреляции на ламелях с помощью световой и электронной микроскопии для размолотых крио-FIB клеток, чтобы структурно охарактеризовать и подтвердить идентичность LB в их невозмущенном состоянии.Используя деконволюцию и регистрацию трехмерных изображений, мы смогли идентифицировать флуоресцентно меченые мембранные структуры, проанализированные с помощью криоэлектронной томографии. Криоэлектронная томография in situ клеток A549, а также первичных эпителиальных клеток малых дыхательных путей человека показала, что LB состоят из мембранных листов, часто прикрепленных к ограничивающей мембране через «Т» -соединения. Мы сообщаем о пока неописанном белковом комплексе купола внешней мембраны (OMDP) ​​на ограничивающей мембране LBs. Наши данные предполагают, что биогенез LB управляется параллельным импортом мембранных листов и кривизной ограничивающей мембраны, чтобы максимизировать емкость хранения липидов.

Тематические термины: Флуоресцентная визуализация, Органеллы, Криоэлектронная томография, Криоэлектронная микроскопия

Введение

Пластинчатые тела (LB) — это специализированные органеллы, обнаруженные исключительно в эпителиальных клетках альвеолярного типа 2 (AEC2) и в кератиноцитах ¹ . Альвеолярные LB продуцируют, накапливают и секретируют сурфактант, смесь специализированных липидов и белков. После секреции в альвеолярную полость он быстро распадается на высокоорганизованную сеть.Легочный сурфактант снижает поверхностное натяжение на границе раздела воздух-вода в альвеолах, облегчая газообмен во время дыхания. Следовательно, его необходимо постоянно пополнять для поддержания дыхания ² . AEC2 и сурфактант являются основными участниками легочного иммунного ответа ³ . Дефекты производства сурфактанта связаны с повышенным риском респираторной инфекции патогенами, такими как вирус гриппа A ⁴ , респираторно-синцитиальный вирус ⁵ , пневмония ⁶ и Mycobacterium tuberculosis ⁷ .Поверхностно-активный белок D (SP-D) специфически связывает гликозилированные патогены, включая SARS-CoV-1 ⁸ . Метаболизм жирных кислот AEC2 и ультраструктура LB серьезно нарушены пандемическим штаммом гриппа h2N1 ⁹ и высокопатогенным штаммом H7N9 ¹⁰ . Несмотря на их важность для здоровья и болезней, многие вопросы о биогенезе, структуре и секреции LB остаются открытыми. LB состоят из ядра, содержащего многослойные мембранные листы, окруженные ограничивающей мембраной, как показывает просвечивающая электронная микроскопия (TEM) тонких срезов ¹¹ .LB содержат 85% фосфолипидов по весу, в основном дипальмитоил-фосфатидилхолин (DPPC), ненасыщенные фосфатидилхолины, фосфатидилглицерины ¹² , а также холестерин и специализированные поверхностно-активные белки A, B и C (SP-A, SP-B и SP В) ¹³ . Большинство LB-ассоциированных белков обычно обнаруживаются в лизосомах, поэтому LB классифицируются как связанные с лизосомами органеллы. Масс-спектрометрия идентифицировала 34 белка, уникальных для легких LB ¹³ . В то время как ядро ​​содержит небольшие гидрофобные белки SP-B и SP-C ¹⁴ , ограничивающая мембрана обогащена флиппазой, член АТФ-связывающей кассеты, член 3 подсемейства A (ABCA3) ¹⁵ .

В текущей модели биогенеза LB липиды переворачиваются с помощью ABCA3 из цитозольного листка в просвет просвета и импортируются в ядро ​​LB ¹⁶ , где SP-B и SP-C отвечают за дальнейшую перестройку липидов в плотно упакованные мембранные листы ¹⁷ . Однако эту модель было трудно проверить. Высокое содержание липидов в LB плохо сохраняется в результате подготовки образца ПЭМ при комнатной температуре, который основан на химической фиксации и дегидратации.В результате концентрические мембраны внутри LB выглядят сморщенными. Таким образом, неясно, как они организованы в трехмерном (3D) пространстве, и неизвестно, как формируются пакеты мембран. Исследование с использованием криоэлектронной микроскопии (EM) застеклованных срезов (CEMOVIS) на легких крыс позволило визуализировать замороженные гидратированные LB и показало гладкие концентрические мембраны ¹⁸ . Однако из-за артефактов сжатия, вызванных секционированием, и отсутствия совместимости с криоэлектронной томографией (cryo-ET) ¹⁹ , исследование дало лишь небольшое понимание сложной архитектуры LB.

В отличие от CEMOVIS, фрезерование крио-сфокусированным ионным пучком (крио-FIB) позволяет изготавливать тонкие ячеистые ламели произвольной толщины с гладкой поверхностью и без сжатия, так что они совместимы с cryo-ET ^20,21 . Корреляция света и ЭМ (CLEM) позволяет однозначно идентифицировать целевые отсеки и дает структурные детали ²² . Методы CLEM были адаптированы для крио-ЭМ и успешно реализованы на образцах in vitro ^23,24 или для крио-ЭТ, выполненных на целых клетках ^25–28 .Однако корреляция данных световой микроскопии (LM) и EM в рабочем процессе, включающем измельчение крио-FIB, является сложной задачей из-за геометрии измельчения и многократного переноса между микроскопами: каждый перенос увеличивает риск расстекловывания образца и загрязнения льда. До сих пор доступные рабочие процессы крио-CLEM in situ, включающие измельчение крио-FIB, нацелены на измельчение крио-FIB на месте ^29,30 , но не обеспечивают целевой проверки.

Здесь мы показываем, что точное знание положения ламеллы в контексте всей клетки, определяемое крио-LM после крио-ТЕМ-визуализации, способствует точному отображению исходных данных LM в клеточные структуры на ламелле.В представленном рабочем процессе применяется двумерная корреляция для определения интересующей области для фрезерования в плоскости X – Y сетки. Затем применяется второй этап корреляции с использованием данных LM, полученных после крио-ПЭМ-визуализации, деконволюции и трехмерной корреляции, для идентификации наблюдаемых структур, соответствующих положению ламеллы не только по X – Y, но и по Z-измерению. Мы показываем, что последнее важно для повышения точности корреляции путем вычислительного удаления флуоресцентных сигналов вне ламелей.

Мы применили посткорреляционный процесс крио-CLEM на ламелях для изучения LB в клетках A549, модели для AEC2 ³¹ , которые были временно трансфицированы ABCA3-eGFP, хорошо охарактеризованным маркером LB ¹⁵ . После обеих стадий корреляции 76% сигнала ABCA3-eGFP соответствовали мембраносвязанным органеллам, содержащим везикулы или ламеллированные мембраны, типичные для LB. In situ крио-ЭТ позволило нам структурно охарактеризовать мембранную организацию в ABCA3-eGFP-положительных LB без артефактов пробоподготовки.Сердечник LB представляет собой плотно упакованные листы мембраны различной кривизны. Мы обнаружили параллельные двухслойные листы, соединенные перпендикулярно ограничивающей мембране через «Т» -переходы, и концентрические двухслойные листы в качестве отличительных структур СП. Кроме того, наша работа выявила большой белок купола внешней мембраны (OMDP) ​​на ограничивающей мембране некоторых LBs, предположительно участвующих в их образовании и перемещении. Чтобы подтвердить наши выводы, мы проанализировали LB в первичных клетках легких человека, где мы наблюдали как «Т» -соединения, так и OMDP.

Результаты

Дизайн рабочего процесса крио-CLEM на ламелях после корреляции

Целью этого рабочего процесса корреляции является (i) применимость к прилипшим клеткам, выращенным непосредственно на крио-ЭМ сетках, (ii) совместим с коммерчески доступными установками крио-LM с широким полем зрения, и (iii) для обеспечения проверки цели путем корреляции флуоресцентного сигнала, полученного из положения ламеллы, с крио-ТЕМ-картой ламеллы. Мотивация заключается в создании надежного метода крио-CLEM, который можно легко адаптировать.Для этого предусмотрены все необходимые скрипты и программные плагины (см. Раздел «Доступность кода»).

Целью этого рабочего процесса крио-CLEM на ламелях является точная локализация сигнала флуоресценции, полученного от ламели, с помощью карты крио-ТЕМ как в плоскости X – Y, так и в Z-измерении. В то время как первое является простым, второе затруднительно, потому что (i) Z-размер ламели уменьшается до менее 5% от первоначального Z-размера ячейки (криоламеллы имеют толщину 150-200 нм, в то время как интактная клетка имеет толщину 4–6 мкм) и (ii) крио-LM имеет ограниченное Z-разрешение.Чтобы преодолеть эти трудности, мы реализовали посткорреляционный процесс крио-CLEM на ламеллах, который использует деконволюцию крио-LM 3D-карт клетки до и после приготовления крио-ламеллы (рис.). Мы выбрали выполнение крио-LM получения крио-ламелей после крио-ПЭМ-визуализации, поскольку визуализация в крио-LM увеличивает загрязнение льда и, следовательно, снижает качество крио-ЭТ. Это приводит к потере флуоресценции на ламелях из-за повреждения электронным пучком, происходящего во время крио-ЭТ. Поэтому мы использовали неотображаемое окружающее тело клетки, которое сохраняет свою флуоресценцию, для регистрации крио-LM-карты, полученной до и после получения крио-ТЕМ (дополнительный рис.1). Мы используем крио-LM-карту, полученную после крио-ТЕМ, для определения положения ламелей и наклона, в то время как мы используем исходную крио-LM-карту, полученную до измельчения, для получения сигнала флуоресценции. После трехмерной регистрации двух деконволюционных крио-LM-карт можно измерить наклон ламели, используя сигнал светлого поля в проходящем свете (TL-BF) в плоскости Z – Y, и соответственно наклонить весь составной стек. Это позволяет нам выделить один срез зарегистрированного и скорректированного по наклону стека изображений, содержащий только флуоресцентный сигнал, соответствующий ламелле.Используя жесткую трансформацию, эту карту флуоресценции можно, наконец, сопоставить с картой крио-ТЕМ, облегчая идентификацию интересующей структуры, анализируемой крио-ЭТ. Поскольку корреляция карт крио-LM и крио-ТЕМ выполняется после крио-ЭТ, мы назвали этот подход «посткорреляционная крио-CLEM на ламелях».

Схема рабочего процесса посткорреляционной крио-CLEM на ламелях.

Рабочий процесс состоит из двух частей: сбора данных ( a — d ) и обработки данных для корреляционного анализа ( e — g ).Структуры в клетках, выращенных на ЭМ сетках, перед витрификацией флуоресцентно метят путем замораживания погружением. a На первом этапе застеклованный образец картируется с помощью крио-LM, получая Z-стопки с интервалом 300 нм. b На втором этапе меченые клетки истончаются с помощью крио-FIB-измельчения для получения ламелей толщиной 150–200 нм. c Пластинки картированы с помощью крио-ТЕМ и получены серии наклона интересующих областей. d FIB-фрезерованные области снова картируются с помощью cryo-LM для определения точного положения ламелей.Для обоих Z-стеков шага ( a ) и шага ( d ) деконволюция выполняется для увеличения разрешения (не показано на рисунке). e Для объединения информации о флуоресцентном сигнале с этапа ( a ) и положения ламелей с этапа ( d ) оба Z-стека выравниваются с использованием алгоритма автоматической трехмерной регистрации. После регистрации изображения канал светлого поля в проходящем свете (TL-BF) этапа ( d ) объединяется с флуоресцентными каналами этапа ( a ), что приводит к комбинации положения ламелей и флуоресцентного сигнала в едином композитном Z- куча. f Чтобы компенсировать наклон ламелей, наклон измеряется с использованием сигнала TL-BF, Z-стопка поворачивается соответствующим образом и извлекается Z-срез, соответствующий ламелям. g Наконец, извлеченный Z-срез регистрируется в карте крио-ТЕМ с этапа (c ).

В качестве доказательства принципа мы первоначально применили рабочий процесс посткорреляции на ламеллах крио-CLEM для локализации флуоресцентно меченных липидных капель (LD) в клетках A549, поскольку LD легко различимы с помощью крио-ЭМ.Мы могли проверить все LD ( n = 11), идентифицированные крио-ЭМ на 4 криоламелях с помощью нашего корреляционного подхода (дополнительный рис. 2) со средней точностью корреляции X – Y 124 нм (стандартное отклонение (SD) = 41 нм, n = 11). Затем мы проанализировали влияние коррекции наклона и извлечения одного среза X – Y нашего рабочего процесса. С этой целью мы повторили корреляцию четырех ламелей, но вместо извлеченного среза X – Y флуоресцентной карты мы использовали проекцию максимальной интенсивности (MIP).Сравнение обеих корреляций (дополнительный рис. 3) показало, что коррекция наклона и извлечение одного среза X – Y важны для рабочего процесса и уменьшают сигнал вне ламелей на 66%. Корреляция с использованием флуоресцентной карты MIP показала 35 сигналов LD вне ламелей, которые соответствуют LD, удаленным во время измельчения крио-FIB. Путем коррекции наклона и извлечения одного среза X – Y мы смогли уменьшить количество сигналов вне ламелей с 35 до 12.

Посткорреляционный рабочий процесс крио-CLEM на ламелях показывает, что ABCA3-eGFP преимущественно коррелирует с ламеллированными мембранными органеллами

Для локализации LB в клетках A549 мы использовали избыточную экспрессию ABCA3-eGFP, которая индуцирует образование LB14-подобных органелл .Через 48 часов после трансфекции клетки A549 содержали в среднем 127 больших сферических структур на клетку (SD = 50, диапазон: 45–179). Сигнал ABCA3-eGFP преимущественно локализован на ограничивающей мембране и показывает средний диаметр 1,2 мкм (SD = 0,8 мкм, диапазон: 0,1–4,5 мкм), как показывает конфокальная микроскопия (дополнительный рис. 4). Эти измерения соответствуют ранее сообщенному диаметру LB (диапазон: 0,1–2,4 мкм), основанному на исследованиях ЭМ, выполненных на клетках легких ¹ . Мы временно трансфицировали клетки A549, выращенные на золотых ЭМ сетках, и дополнительно окрашивали их ядерным красителем и нейтральным липидным красителем, маркирующим ЛД, с намерением использовать их в качестве реперных маркеров, тем самым увеличивая точность корреляции.Однако избыточная экспрессия ABCA3-eGFP приводит к истощению LD в клетках. Кроме того, нейтральный липидный краситель также локализован в ядре ABCA3-eGFP-положительных органелл (дополнительный рис. 5), что не позволяет нам использовать их в качестве реперных маркеров. После стеклования путем погружного замораживания образец переносили при криогенных температурах в крио-LM для картирования сетки ЭМ. Z-стеки в проходящем свете светлого поля (TL-BF) и флуоресцентных каналах были получены, покрывая большую площадь (примерно 1,2 мм × 1.2 мм) сетки, чтобы максимально увеличить количество потенциальных областей для последующего фрезерования. Чтобы улучшить контраст и уменьшить сигнал рассеянного света установки широкопольного микроскопа, а также для повышения точности корреляции, мы выполнили деконволюцию крио-LM данных (дополнительный рис. 6). После деконволюции мы смогли различить близко расположенные ABCA3-eGFP-положительные органеллы, которые до деконволюции выглядели как одна органелла (дополнительный рис. 6d – j). MIP и сшивание данных крио-LM были использованы для создания карты, из которой были выбраны подходящие области, демонстрирующие большие ABCA3-eGFP-положительные органеллы для измельчения (рис.). В большинстве случаев надрезы для снятия напряжения, расположенные рядом с криоламелями, использовались для уменьшения изгиба криоламелей перед заключительным этапом фрезерования ³² . Сетки, содержащие от четырех до шести самонесущих ламелей (рис.), Были перенесены в крио-ТЕМ, где они были нанесены на карту, чтобы судить об общем качестве ламелей и локализовать мембраносвязанные органеллы (рис.). Среди часто присутствующих органелл, таких как митохондрии и ядра, мембранные структуры с ламелированной мембранной архитектурой были выбраны для крио-ЭТ в качестве предполагаемых LBs.Чтобы получить флуоресцентную карту размолотых клеток для пост-корреляции на ламеллах, сетки картировали второй раз с помощью крио-LM после извлечения из крио-ТЕМ (рис.). Фрезерованные области на сетке не показали какого-либо специфического флуоресцентного сигнала, вероятно, из-за повреждения луча электронами, тогда как флуоресценция в окружающем теле клетки сохранилась (дополнительный рисунок 1). В некоторых случаях загрязнение льда, обнаруженное в TL-BF на ламелле, приводило к появлению автофлуоресцентного сигнала во всех флуоресцентных каналах (рис., звездочка). Флуоресцентные изображения клетки до и после крио-ПЭМ для всех проанализированных ламелей показаны на дополнительном рис. 1. Для получения флуоресцентного сигнала, соответствующего положению ламеллы, мы использовали регистрацию трехмерного изображения и жесткое преобразование с использованием одного из деконволюционных каналов флуоресценции для наложения оба объема изображения (рис.). Потеря флуоресцентного сигнала при использовании разрезов для снятия напряжения была незначительной и, следовательно, не препятствовала корреляции. Полученный комбинированный стек изображений включает флуоресцентный сигнал до фрезерования FIB с сигналом TL-BF после фрезерования, который содержит точное положение ламелей.Флуоресцентная карта, соответствующая ламелям, была извлечена из комбинированного стека изображений путем корректировки угла фрезерования (рис.) И, наконец, путем извлечения среза, соответствующего плоскости ламели (рис.). Мы использовали четыре угла ламеллы, а также четко идентифицируемые флуоресцентно меченые маркеры, такие как ядерная оболочка, в качестве ориентиров для корреляции извлеченного Z-среза с картой крио-ТЕМ (рис.) С помощью нежесткой трансформации. Из-за потери LD из-за сверхэкспрессии ABCA3 (дополнительный рис.5) мы не смогли использовать LD в качестве реперных маркеров, которые могли бы еще больше улучшить точность корреляции по X – Y. Детальный вид коррелированной карты крио-ТЕМ показал, что сигнал ABCA3-eGFP перекрывается с многослойными структурами (рис.).

Посткорреляция крио-CLEM на ламелях позволяет идентифицировать LB-подобные структуры.

Клетки A549, выращенные на EM-сетках, временно трансфицировали ABCA3-eGFP, а ядра и липидные капли флуоресцентно метили перед погружением-замораживанием. — это MIP деконволютированного набора крио-LM, полученный до FIB-измельчения. ABCA3-eGFP показан зеленым цветом, а ядра и липидные капли — голубым. b Изображение FIB под углом, показывающее одну и ту же область до и после фрезерования, соответственно. c Сшитая крио-ПЭМ карта ламели, полученная методом фрезерования FIB, полученная при увеличении 8700 ×. Белые стрелки показывают ориентиры, используемые для корреляции. d MIP деконволютированного набора крио-LM, полученного после получения изображений с помощью ПЭМ.Флуоресцентный сигнал в теле клетки остается видимым (стрелки). Загрязнение льда на пластинке (звездочка) показывает автофлуоресценцию, которая обнаруживается во всех флуоресцентных каналах и, таким образом, не испускается ABCA3-eGFP. e MIP зарегистрированного и выровненного стека изображений. f Z – Y срез, показывающий наклон ламелей, соответствующий углу фрезерования FIB (вверху) и Z – Y срез после поворота Z-стопки на 5 °. Края пластинки, покрытые металлоорганической платиной (стрелки), можно увидеть в виде темных точек на Z – Y-срезе. г Извлеченный Z-срез, соответствующий плоскости ламели, с вычислительно удаленным флуоресцентным сигналом вне ламели. Белые стрелки указывают ориентиры, наложенные на ( c ). h Наложение, показывающее результат нежесткого совмещения между ТЕМ-картой на панели ( c ) и флуоресцентным изображением на панели ( g ). i Изображение коррелированной ламели с большим увеличением. j Количественная оценка корреляции с мембраносвязанными органеллами.Всего 62 различных коррелированных сигнала eGFP от 6 ламелей были отнесены к соответствующим структурам карты крио-ТЕМ. Двадцать восемь сигналов ABCA3-eGFP были отнесены к LB, 19 — к мембраносвязанным органеллам и 15 не могли быть отнесены к какой-либо структуре. k Количественная оценка точности корреляции. Для 47 успешно коррелированных структур расстояние и угол до центра соответствующего сигнала ABCA3-eGFP были измерены и показаны на радиолокационном графике. Средняя точность корреляции составляет 450 нм (SD = 249 нм).Масштабные линейки: a , d , e , g 20 мкм, c , f , h 5 мкм, i 1 мкм.

Мы классифицировали структуры, соответствующие изолированным сигналам ABCA3-eGFP ( n = 62) на шести ламелях. В результате 45% сигнала ABCA3-eGFP может быть отнесено к органеллам, содержащим ламелированные мембраны со смещением менее 1 мкм. В целом, 31% сигнала ABCA3-eGFP коррелировал с мембраносвязанными структурами, включая мультивезикулярные тельца (MVB), эндоплазматический ретикулум (ER) или везикулы.Оставшиеся 24% сигнала ABCA3-eGFP не могут быть отнесены к каким-либо мембраносвязанным органеллам, связанным с ABCA3 (рис., Дополнительные данные 1). Коррелированные структуры показали среднее смещение к локальным максимумам соответствующего сигнала ABCA3-eGPF 450 нм (SD = 249 нм) (рис., Дополнительные данные 1). Чтобы оценить значимость извлечения только сигнала, соответствующего ламелям на этом образце, мы также выполнили корреляцию на основе MIP собранной стопки с поправкой на наклон для трех ламелей.В отличие от извлеченных срезов, 57% сигналов крио-LM нельзя было отнести к каким-либо мембраносвязанным органеллам, наблюдаемым с помощью крио-ТЕМ, когда для корреляции использовался MIP. Это подтверждает наш анализ LD (дополнительный рисунок 3), показывая, что коррекция наклона и выделение одного среза X – Y улучшает корреляцию. Таким образом, мы могли коррелировать 76% сигнала ABCA3-eGFP со средней точностью корреляции X – Y 450 нм с мембраносвязанными органеллами, из которых 45% имели ламелированную морфологию.

LB содержат плотно упакованные мембранные листы с параллельной изогнутостью, часто соединенные с ограничивающей мембраной «Т» -переходами.

Мы проанализировали трехмерную архитектуру мембраны на 11 томограммах, содержащих ABCA3-eGFP-положительные органеллы. Все коррелированные органеллы обнаруживают внутрипросветные пузырьки и плотно упакованные мембранные листы различной кривизны и с регулярным интервалом в ядре (дополнительный рис. 7). В LB, показывающих большую концентрическую ламелированную архитектуру (рис., Дополнительный фильм 1), мы наблюдали, что кривизна мембранных листов увеличивается к центру, одновременно со сферической трехмерной организацией параллельных листов.Детальный анализ регулярного расстояния между мембранами с помощью быстрого преобразования Фурье (БПФ) центральной области (рис.) Выявил три основные частоты, которые соответствуют межголовному расстоянию (3,7 нм ^-1 ), ширине бислоя (5,6 нм ^{— 1} ) и двухслойного повтора (11 нм ^-1 ). Это подтверждается графиком линии плотности той же площади (рис.). Кроме того, мы наблюдали кристаллическую липидную структуру с латеральным повторением 3,4 нм, как измерено с помощью БПФ (рис.).

Cryo-ET органелл LB выявляет мембранную упаковку с параллельной изогнутой поверхностью из мембранных листов и кристаллических липидных структур.

a Центральный срез восстановленной томограммы, полученной на участке коррелированного сигнала ABCA3-eGFP (корреляция показана на дополнительном рис. 7k, l). b Детальный вид параллельной изогнутой мембранной организации сердечника LB. c Анализ БПФ расстояния между изогнутыми параллельно изогнутыми мембранами, область, используемая для анализа БПФ, указана в ( a ). БПФ-анализ выявляет три основные частоты: 3,7 нм ^-1 (головная группа – головная группа), 5,5 нм ^-1 (ширина двухслойного слоя) и 11 нм ^-1 (двухслойный повтор). d График профиля линии, обозначенный пунктирной линией в ( b ), показывает расстояние между мембранами. e Детальный вид кристаллических липидных структур внутри LB. f В кристаллическом липидном ядре наблюдаются параллельные листы. г БПФ-анализ параллельных листов кристаллической липидной структуры, область, используемая для БПФ-анализа, указана в ( e ). БПФ-анализ показывает, что интервал составляет 3,4 ^-1 нм. h График профиля линии, обозначенного пунктирной линией в ( f ).Восстановленная томограмма визуализируется как дополнительный фильм 1. Масштабные полосы: a 200 нм, e 50 нм, b , f 50 нм.

Хотя мембранные листы в параллельном изогнутом расположении чаще всего встречались в LB, спирально-спиральные мембранные листы, а также мембраны, образующие закрытые отсеки, также наблюдались внутри ядра LB (рис., Дополнительные видео 2 и 3). Так как клеточные мембраны преимущественно образуют закрытые компартменты, мы затем проанализировали концы параллельных мембранных листов, чтобы понять, как структурно организован конец бислоя.Часто наблюдались округлые плотности на концах бислоя, указывающие на то, что ацильные цепи фосфолипидов не подвергаются воздействию водной среды (фиг., Стрелки). Интересно, что мембранные листы обычно находились перпендикулярно к ограничивающей мембране LB. Эти листы часто соединялись с ограничивающей мембраной LB с тонкой плотностью (рис.). Исходя из перпендикулярной формы соединения, мы называем эти прямые контакты Т-образными соединениями.

Крио-ЭТ LB-подобных органелл выявляет структурные детали концов мембранных листов и «Т» -соединений.

a Центральный срез восстановленной томограммы, полученной на участке коррелированного сигнала ABCA3-eGFP (корреляция показана на дополнительном рис. 7a, b). b Ручная визуализация томограммы ( a ). Ограничивающая мембрана LB отмечена желтым цветом, листы мембраны — зеленым. Для выделения отдельных листов мембраны использовались чередующиеся оттенки зеленого. Сплошные мембраны отмечены красным. Лист мембраны, свернутый спиралью, помечен оранжевым цветом. c — e Детальный вид реконструированной томограммы. Перпендикулярно ориентированные мембранные листы к ограничивающей мембране часто соединяются тонкой плотностью («Т» -соединение) с ограничивающей мембраной LB (стрелки). Листы мембраны показывают округлую плотность на концах мембраны (стрелки). f — h 3D-рендеринг детальных видов ( c — e ). Этот рисунок отображается как дополнительные фильмы 2 и 3. Масштабные полосы: a 200 нм, c — e 50 нм.

Куполообразные белковые комплексы локализованы на ограничивающей мембране LBs

После более тщательного изучения ограничивающих мембран LB-подобных органелл мы наблюдали куполообразный белковый комплекс, далее называемый OMDP (рис.). OMDP выглядели полыми и были обнаружены в непосредственной близости от цистерн ЭПР, частично украшенных рибосомами (рис.). Хотя OMDP были редки ( n = 4) в клетках A549, трансфицированных ABCA3-eGFP, они часто наблюдались ( n = 171) на ограничивающей мембране LB и MVB в долгосрочной культуре A549 по девяти томограммам (дополнительный рис. .9), а также на лимитирующей мембране предшественников LB в клетках HSAEpC ( n = 4) (рис.). Чтобы получить представление о структуре OMDP, мы вручную извлекли субтомограммы ( n = 116), содержащие OMDP, из двух томограмм и выполнили усреднение субтомограмм (STA) в Dynamo ³³ . STA OMDP выявил полую куполообразную структуру (рис.) С диаметром основания 30 нм, высотой 22 нм с изломом 7 нм и диаметром вершины 16 нм. Поиск симметрии, выполненный по вычисленному среднему, показал, что OMDP имеет симметрию C ₈ .

Белок купола внешней мембраны (OMDP), наблюдаемый на лимитирующей мембране предшественников LB в первичных клетках легких A549-ABCA3-eGFP и HSAEpC.

a Коррелированное изображение ламели с сигналом ABCA3-eGFP, перекрывающимся с предшественниками MVB и LB. Ядро и митохондрии (митохондрии) не показывают сигнал ABCA3-eGFP. b Срез томограммы, соответствующий области, указанной в ( a ). Показана цистерна ER. Рибосомы отмечены стрелками. c , d Два разных среза одной и той же томограммы, соответствующие области, указанной в ( b ). Сборка OMDP на ограничивающей мембране LB, обращенной к мембране соседней мембраны ER. Всего на томограмме ( b ) присутствуют три идентичных узла. e Срез томограммы, показывающий предшественник LB, содержащий параллельные мембранные листы, соединенные с ограничивающей мембраной (стрелка) в первичных клетках легких HSAEpC. LB находится вблизи промежуточных филаментов (IF), липидных капель (LD) и эндоплазматического ретикулума (ER).OMDP расположен на ограничивающей мембране LB (пунктирный квадрат). f Срез томограммы, показывающий предшественник LB с изогнутыми листами мембраны и OMDP, расположенный на ограничивающей мембране LB (пунктирные квадраты). g , h Детали томограммы, показывающей OMDP, соответствующие отмеченной области в ( e , f ). i — k Срезы через STA 105 OMDP, обнаруженных на двух томограммах. i представляет XZ-срез через центр OMDP, j показывает XY-срез через центр, а k через верх OMDP. l Изоповерхность STA после применения симметрии C ₈ . Масштабные линейки: a 5 мкм, b , e , f 200 нм, c , d , g , h 20 нм, i — k 10 нм , l 10 нм.

Первичные клетки легких показывают органеллы LB с «Т» -соединениями и OMDP

Чтобы подтвердить, что архитектура LB, индуцированная экспрессией ABCA3-eGFP в клетках A549, представляет архитектуру физиологически сформированных LB, мы использовали первичные эпителиальные клетки малых дыхательных путей человека. (HSAEpC), выделенный из дистальной части дыхательных путей человека, а также включал долгосрочные культуры A549, которые, как ранее было показано, восстанавливают дифференцированный фенотип с повышенной продукцией LB, как обнаружено в первичных клетках AEC2 ³⁴ .In situ крио-ЭТ размолотого HSAEpC выявило ламеллированные органеллы (фиг., Дополнительный фиг. 8) на десяти проанализированных томограммах, согласующихся с LB, наблюдаемыми в клетках A549, сверхэкспрессирующих ABCA3. Важно отметить, что LBs, обнаруженные в HSAEpC, содержали мембранные листы, прикрепленные к LB ограничивающей мембране через T-соединения (Fig.), А изогнутые ламелированные мембраны были менее конденсированными (Fig.). LB в клетках HSAEpC часто обнаруживались вблизи промежуточных филаментов (рис.). Кроме того, цельноклеточный крио-ЭТ долгоживущих клеток A549 также выявил LB (дополнительный рис.9) на 6 из 21 проанализированной томограммы. Они проявляли морфологию, сходную с LBs, продуцируемыми сверхэкспрессией ABCA3-eGFP, и имели средний диаметр 0,58 мкм (SD = 0,25 мкм, диапазон: 0,24–1,1 мкм). В соответствии с ранее опубликованными данными ³⁴ , мы обнаружили ламелированные структуры только на 1 из 15 проанализированных томограмм краткосрочных нетрансфицированных клеток A549, что указывает на то, что частое расщепление клеток A549 препятствует образованию LB.

Обсуждение

В этом исследовании мы представляем рабочий процесс для посткорреляционной крио-CLEM на ламелях и используем его для изучения трехмерной ультраструктуры LB в невозмущенных условиях.Подходы CLEM широко используются с химически фиксированными или замороженными-замороженными образцами под высоким давлением для идентификации целевых структур и редких клеточных событий ²² . Однако такие методы неизбежно подвергаются риску из-за артефактов пробоподготовки из-за дегидратации, последующего окрашивания и разделения проб. В частности, плохо сохраняется структура мембран и богатых липидами органелл из-за экстракции липидов, происходящей во время дегидратации образца органическими растворителями. Крио-ЭМ позволяет непосредственно визуализировать мембранные структуры, близкие к их естественному состоянию.Корреляционные подходы, такие как крио-CLEM, могут применяться для идентификации молекул в образце стекловидного тела при условии, что образец остается застеклованным и свободным от ледяного загрязнения во время передачи между крио-LM и крио-ТЕМ ²³ . До сих пор рабочие процессы cryo-CLEM, включающие фрезерование cryo-FIB, основывались на высокоточной трехмерной корреляции для фрезерования на конкретном участке для нацеливания на интересующую область. Публикация Арнольда и др. ²⁹ сообщили о подготовке ламелл с трехмерным нацеливанием на основе корреляции крио-LM и крио-FIB / SEM.Этот рабочий процесс был установлен на суспендированных клетках, смешанных с флуоресцентными шариками, и требовал больше не распределенной криостадии для конфокального микроскопа с вращающимся диском. При таком подходе точность корреляции чувствительна к количеству и распределению больших контрольных точек и дрейфу, происходящему во время фрезерования ²⁹ . Представленный здесь рабочий процесс полезен в том смысле, что он позволяет проверять целевые структуры после измельчения крио-ФИП. Комбинирование описанного здесь посткорреляционного подхода на ламеллярной крио-CLEM с ранее описанным целевым фрезерованием ^29, позволит подтвердить нацеливание и гарантировать отсутствие несоответствия флуоресцентного сигнала и прогнозируемого положения томограммы из-за дрейфа стадии.

Недавно был разработан прототип микроскопа с крио-ЛМ, интегрированным в камеру микроскопа с крио-ФИП ³⁵ . Это позволяет контролировать флуоресцентный сигнал во время фрезерования и на готовой пластине. Затем этот сигнал можно напрямую скоррелировать без передачи образца.

В этом исследовании мы реализовали альтернативную стратегию и разработали надежный метод крио-CLEM на ламелях, используя преимущества посткорреляции. Он подходит для прилипших клеток, культивируемых непосредственно на ЭМ-сетках без введения реперных шариков с использованием коммерчески доступного крио-LM Leica.Хотя ряд наклона (TS) не может быть получен на основе априорно полученной информации о флуоресценции, посткорреляционный подход дает возможность коррелировать только высококачественные ламели стекловидного тела, оцененные с помощью крио-ПЭМ. Большинство наших попыток выполнить крио-ЛМ после измельчения, но до крио-ПЭМ, приводили к увеличению загрязнения пластинок льдом, что препятствовало получению высококачественного крио-ЭТ. Кроме того, мы редко обнаруживали флуоресценцию непосредственно на ламелях, что могло быть связано с ограничениями чувствительности широкоугольного крио-LM Leica.

Хотя деконволюция широкопольного крио-LM успешно использовалась для визуализации тканей ³⁶ , деконволюция не была полностью применена в крио-LM застеклованных образцов для приложений крио-CLEM. Мы показываем, что деконволюция широкопольных данных крио-LM является необходимым шагом для успешной корреляции и, таким образом, должна применяться также к другим стратегиям крио-CLEM. Вычислительная коррекция наклона и извлечение срезов имеют решающее значение для рабочего процесса даже для больших органелл, таких как LB.При совместном применении количественная оценка показала, что 76% сигнала ABCA3-eGFP локализованы в мембраносвязанных структурах и органеллах LB. Остаточные 24% сигналов не могут быть отнесены к каким-либо структурам, подобным MVB / LB, вероятно, из-за ограниченного осевого разрешения широкопольной микроскопии. Несмотря на то, что деконволюция может улучшить как латеральное, так и осевое разрешение, оно остается сильно анизотропным и намного превышает толщину ламелей 150–200 нм. Точность корреляции описываемой установки микроскопа ограничена аберрациями и числовой апертурой (NA), равной 0.9 из 50-кратного объектива, используемого в крио-LM, что, в частности, влияет на разрешение в Z-направлении. Разработка линз с улучшенной коррекцией аберраций, криоиммерсионных линз с более высоким NA ³⁷ и реализация крио-LM с конфокальным разрешением или сверхвысоким разрешением могут дополнительно улучшить Z-разрешение ³⁸ и тем самым способствовать более точному удалению флуоресцентного сигнала вне ламелей в процессе посткорреляции. Сверхэкспрессия ABCA3-eGFP приводила к меньшему количеству LD по сравнению с не сверхэкспрессирующими клетками A549 (дополнительный рис.5). Возможно, что сверхэкспрессия ABCA3 приводит к мобилизации нейтральных липидов в LD для синтеза фосфолипидов. Таким образом, мы не смогли использовать LD в качестве маркеров корреляции, и окончательная корреляция была выполнена с использованием углов ламели, что ограничило точность корреляции X – Y до 450 нм (рис.). Для сравнения мы смогли сопоставить флуоресцентно меченые ЛД с точностью X – Y 124 нм. Из-за характерной сферической морфологии ЛД и их повышенной электронной плотности, распознаваемой крио-ЭМ, ЛД можно использовать в качестве реперных маркеров для повышения точности корреляции.Cryo-LM, выполняемый при низкой относительной влажности (30–40%), улучшает как данные cryo-LM, так и измельчение крио-FIB. Следовательно, интеграция крио-LM-визуализации в камеры крио-FIB / SEM, которая позволяет получать данные флуоресценции до и после измельчения крио-FIB ³⁵ , является большим преимуществом, позволяющим избежать переноса образцов.

Ультраструктура LB уже давно является предметом споров. Как параллельные прямые, так и концентрические мембранные листы были предложены в качестве основных структурных компонентов LB, и оба типа наблюдались в CEMOVIS ¹⁸ .Однако артефакты резки и отсутствие 3D-данных помешали дальнейшему пониманию архитектуры органелл. Детальный анализ расстояния между мембранами выявил повторение 11 нм по сравнению с 7,3 нм, обнаруженным с помощью CEMOVIS для легких крыс ¹⁸ . Разница в расстоянии между мембранами может быть объяснена либо сжатием до 50%, которое происходит во время секционирования ¹⁹ , различиями стадий созревания LB или различиями между LB человека и крысы. Тот факт, что первичные клетки легких человека показали менее компактную упаковку ламеллярных мембран, чем клетки A549, сверхэкспрессирующие ABCA3, указывает на то, что расстояние между LBs мембранами вариабельно и созревание LB может зависеть от уровней ABCA3 и его регуляции в первичной или иммортализованной клеточной линии.

Посткорреляция крио-CLEM на ламелях в сочетании с in situ крио-ЭТ положительных органелл ABCA3-eGFP позволила нам разгадать архитектуру LB в 3D. Ядро имеет несколько концентрических мембранных листов с увеличивающейся кривизной к центру. Однако ни одна из наблюдаемых СП не была точно центросимметричной, что ранее было предложено на основе поляризованного LM ³⁹ . «Т» -соединения можно наблюдать на внутренней створке ограничивающей мембраны, где мембраны проталкиваются в липидное ядро ​​в виде параллельных пластин, согласующихся с моделью, предложенной Pérez-Gil ¹⁷ .В дополнение к параллельно изогнутым мембранным листам, мы иногда наблюдали кристаллические липидные структуры внутри ядра LB с регулярным интервалом 3,4 нм ^-1 , как было выявлено с помощью БПФ. Это расстояние соответствует кристаллам сложного эфира холестерина, обнаруженным в LD ⁴⁰ .

Наше открытие, что сигнал ABCA3-eGFP локализуется не только в LBs, но также и в других мембраносвязанных органеллах, таких как MVBs, ER или везикулы, совпадает с предыдущими данными о переносе и протеолитическом процессинге ABCA3 в LAMP3-положительных везикулах ⁴¹ .Однако распределение ABCA3 и его фракция на LB может отличаться в клетках A549 и в первичных клетках легких. Поскольку LBs, обнаруженные в клетках A549, экспрессирующих ABCA3-eGFP, содержат не только ламеллированные мембраны, но также кристаллические липидные структуры и везикулы, эти органеллы, скорее, представляют собой «составные тела», форму предшественника LB. LBs, обнаруженные в первичных клетках легких, были морфологически сходны с таковыми, индуцированными сверхэкспрессией ABCA3-eGFP, что указывает на то, что ни ламеллярная организация, ни «Т» -соединения, обнаруженные в ABCA3-eGFP-положительных органеллах, не являются артефактами сверхэкспрессии.Примечательно, что все LB-подобные органеллы, обнаруженные в HSAEpCs, обнаруживают морфологию ранних предшественников LB, и мы не наблюдали зрелых LBs, которые обнаруживаются в долгоживущих клетках A549 (дополнительный рис. 9). Стоит отметить, что HSAEpC представляют собой смесь типов эпителиальных клеток, только часть которых составляет ACE2 клетки ⁴² . Долгосрочная культура A549 показала повышенное количество органелл по сравнению с краткосрочными нетрансфицированными клетками. Поскольку маркер LB не использовался для локализации LB в долгосрочной культуре A549, мы выполнили крио-ЭТ как на размолотых крио-FIB клетках, так и на периферии целых клеток.Интересно, что большинство крупных LB было обнаружено на периферии клеток долгосрочной культуры A549, где происходит созревание LB и секреция сурфактанта. Посткорреляционный процесс крио-CLEM на ламелях может быть применен для изучения локализации других белков, участвующих в созревании LB, таких как Rab38, который играет незаменимую роль в поддержании морфологии LBs ⁴³ .

Мы идентифицировали куполообразный белковый комплекс на внешней мембране LB как в клетках A549, так и в первичных клетках легких, о котором, насколько нам известно, еще не сообщалось.STA показала, что OMDP демонстрируют структуру, подобную полой клетке, однако ограниченное количество усредненных OMDP не позволяет получить молекулярные детали комплекса. Тем не менее, основываясь на указанной симметрии C ₈ , мы предполагаем, что комплекс построен из множества субъединиц, состоящих из белковых ансамблей, симметрично организованных вокруг одной оси вращения. Примечательно, что мы часто наблюдали структурно хорошо охарактеризованный 13 MDa major vault protein (MVP) в цитозоле клеток A549, который формирует большие клеточные структуры с 39-кратной двугранной симметрией ⁴⁴ .Однако размеры концевых заглушек MVP отличаются от OMDP, что указывает на то, что OMDP не является производным от MVP (дополнительный рисунок 9). Хотя OMDP редко выявлялись в клетках, экспрессирующих ABCA3-eGFP, они часто наблюдались в долговременной культуре A549. Мы полагаем, что низкая встречаемость OMDP в клетках A549 с избыточной экспрессией ABAC3-eGFP может быть объяснена высокой занятостью ABCA3 на ограничивающей мембране, вызывая вытеснение других белков. Так как OMDPs также наблюдались на MVBs, мы предполагаем, что этот комплекс играет более общую роль в эндолизосомном перемещении.Состав OMDP выходит за рамки данного исследования и требует дальнейшего изучения. Поскольку зрелые LBs подвергаются экзоцитозу, мы предполагаем, что OMDPs м. Участвовать в закреплении органелл или в регуляции слияния между ограничивающей мембраной и плазматической мембраной. OMDP можно наблюдать на криоэлектронной томограмме in situ (EMDB 4604) цианобактерий ⁴⁵ , что указывает на то, что комплекс может сохраняться в нескольких сферах жизни и может участвовать в мембранной биологии в целом.

На основе структурного анализа ABCA3-положительных органелл, а также LB, обнаруженных в долгосрочной культуре A549, мы предлагаем модель биогенеза LB (рис.): ABCA3-опосредованная асимметрия липидов мембран заставляет внутренний листок толкать бислои внутрь просвет, образующий «Т» -соединения. Вполне возможно, что сам ABCA3 или другие белки ответственны за концентрацию фосфолипидов в мембранных листах. SP-B представляет собой небольшой белок, который содержит амфипатические спирали ¹⁴ и, таким образом, может быть ответственным за стабилизацию концов мембранных листов и предотвращение их слияния с везикулами.Эти листы отделяются от ограничивающей мембраны LB и имеют форму в соответствии с основной сферической кривизной LB, чтобы максимизировать емкость хранения липидов на данный объем. Наконец, OMDP, наблюдаемый на ограничивающей мембране, может регулировать перенос LB или участвовать в экзоцитозе.

Предлагаемая модель биогенеза LB.

Эта модель биогенеза LB основана на наблюдаемых ультраструктурных особенностях LB с помощью крио-ТЕМ анализа. На всех стадиях биогенеза LB OMDPs присутствуют на лимитирующей мембране LB. a Ранняя стадия: ABCA3 переворачивает фосфолипиды с листочка наружной мембраны на внутренний, что приводит к асимметрии фосфолипидов по направлению к внутреннему листку. Это приводит к образованию мембранных листов, которые напрямую соединяются с ограничивающей мембраной с помощью «Т» -соединений. b Промежуточная стадия: листы мембраны растут дальше и в конечном итоге отделяются от ограничивающей мембраны. Из отдельных листов мембраны начинают складываться изогнутые формы. c Заключительный этап: просвет заполнен листами мембраны, которые образуют комбинацию различных структурных устройств, включая спирально-спиральные, параллельные прямые и изогнутые мембраны, а также кристаллические липидные структуры.

В заключение, мы разработали и внедрили надежный рабочий процесс посткорреляции крио-CLEM на ламеллах, оптимизированный для прикрепленных эпителиальных клеток человека, который совместим с установками крио-LM с широким полем поля. Его можно применять для подтверждения идентичности клеточных органелл с использованием четко определенного флуоресцентного маркера для выявления структурных деталей органелл в контексте нативной клеточной среды.

Методы

Клеточные линии и культура клеток

Клетки A549 ³¹ были приобретены из Европейской коллекции аутентифицированных клеточных культур ECACC (лот 16J012) и культивированы в среде DMEM / F12 (ThermoFisher Scientific) с добавлением 10% (об. / v) фетальная бычья сыворотка (FBS) (ThermoFisher Scientific) и 100 Ед / мл пенициллин-стрептомицин (ThermoFisher Scientific) при 37 ° C, 5% CO ₂ .Первичные человеческие эпителиальные клетки малых дыхательных путей HSAEpC были приобретены у PromoCell (лот 414Z012.2) и использованы в пассаже 3. Клетки HSAEcP поддерживали в базальной среде эпителиальных клеток малых дыхательных путей (PromoCell, C-21275), дополненной средой для роста эпителиальных клеток малых дыхательных путей. Смесь добавок (PromoCell, C-39175) и 100 Ед / мл пенициллин-стрептомицин (ThermoFisher Scientific) в течение 4 недель (среду меняли 3 раза в неделю) и Detach Kit (PromoCell, C-41210) использовали для отделения клеток. из культуральной чашки перед посевом клеток на ЭМ сетки.Долгосрочная культура A549 поддерживалась без субкультивирования в соответствии с протоколом Cooper et al. ³⁴ в Ham’s F12 (Sigma-Aldrich) с добавлением 10% FBS и 100 ед / мл пенициллина-стрептомицина (ThermoFisher Scientific) в течение 28 дней. Среду меняли дважды в неделю. Для приготовления образцов для погружной заморозки сетки Quantifoil ^™ Au R2 / 2 размером 200 меш подвергали плазменной очистке в Gatan Solarus 950 (Gatan) в течение 10 с, стерилизовали погружением в 70% этанол, помещали в 35-миллиметровую чашку ( ThermoFischer Scientific) покрыли тонким слоем полидиметилсилоксана (PDMS, Dow Europe GmbH) и инкубировали в 1 мл среды при 37 ° C в течение 30 мин.Затем среду удаляли и 1,2 × 10 ⁵ клеток высевали на сетки, помещенные в покрытую PDMS чашку, содержащую 2 мл среды. На следующий день клетки временно трансфицировали 3 мкг плазмиды pE-hABCA3-eGFP (экспрессия hABCA3-eGFP контролируется промотором CMV) в реагенте для трансфекции Trans-IT LT1 (Mirus). Через 48 часов после трансфекции среду удаляли и клетки инкубировали в свежей среде, содержащей 1 мкг / мл Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich) и 150 нМ LipiBlue (Dojindo Europe) для окрашивания ядра и LD, соответственно.После 30 мин инкубации клетки трижды промывали средой.

Витрификация

Клетки погружали в жидкий этан сразу после реперного окрашивания с использованием автоматического погружного морозильника Leica EM GP2. Температуру криогена устанавливали на -183 ° C, а в камере — 25 ° C и влажность 95%. Сетки промокали сзади бумагой Whatman ^® Type 1 в течение 4–5 с. Всего 5 мкл среды было добавлено к сетке непосредственно перед погружением в замораживание. Для образцов, которые использовались для томографии целых клеток, были добавлены реперные точки Protein-A Gold с номинальным диаметром 10 нм (Aurion).Сетки были вставлены в AutoGrids ^™ (ThermoFisher Scientific), предназначенные для фрезерования FIB.

Крио-флуоресцентная широкопольная микроскопия

Флуоресцентные карты образцов стекловидного тела были получены с использованием широкопольного микроскопа EM Cryo-CLEM (Leica), оснащенного воздушным объективом 50x (NA 0,9), металлогалогенным источником света (EL6000), воздушным охлаждаемый детектор (DFC9000GT) и криостадия, охлаждаемая до −190 ° C в помещении с относительной влажностью от 40 до 60%. Квадрат примерно 1.2 мм на 1,2 мм было получено в центре сетки с помощью LAS X Navigator. Для каждого поля зрения вокруг точки автофокусировки был получен симметричный Z-стек 30 мкм с интервалом 300 нм. Были использованы следующие каналы: TL-BF, DAPI (Пример: BP 350/50, Em: 460/50) и GFP (Пример: BP470 / 50, Em: 525/50). Файлы TIF были экспортированы из LAS X, а карта MIP была сшита с использованием плагина сшивания Grid / Collection ⁴⁶ в ImageJ / FIJI ⁴⁷ .

Деконволюция данных криофлуоресцентной широкопольной микроскопии

Для повышения четкости сигнала флуоресценции стопки изображений, содержащие интересующие клетки, подвергали деконволюции в AutoQuant X3 (Media Cybernetics).Теоретическая функция рассеяния точки была использована на основе технических характеристик микроскопа и линзы (NA 0,9, линза 50 ×, показатель преломления 1) и уточнена за 100 итераций.

Крио-FIB-SEM-измельчение

После крио-флуоресцентной визуализации самонесущие ламели были приготовлены с использованием крио-FIB-измельчения на двухлучевом микроскопе FIB-SEM Aquilos в комнате с контролируемой относительной влажностью от 30 до 40% ( ThermoFisher Scientific), как впервые описано Rigort et al. ²⁰ . Трансфицированные клетки были отобраны с использованием корреляции со сшитой картой флуоресценции MIP, полученной на предыдущем этапе с использованием MAPS 3.3 (ThermoFisher Scientific). Ячейки покрывали металлоорганическим слоем платины в течение 5–6 с и постепенно утоняли в 4 этапа под углом ступени 15–18 ° с использованием пучка Ga ⁺ , чтобы получить ламели толщиной 150–200 нм после заключительного этапа измельчения. Если возможно, использовались микровыключатели, как описано Wolff et al. ³² для повышения устойчивости ламелей. Прогресс отслеживался с помощью SEM-изображений при 2,2–10 кВ с детекторами ETD и T1.

Серия Tilt и реконструкция томограммы

После подготовки ламелей сетки были перенесены в крио-ТЕМ Titan Krios, работающий при 300 кВ (ThermoFisher Scientific), оборудованный прямым электронным детектором K3 и фильтром изображения Gatan (Gatan).Получение изображения контролировалось с помощью SerialEM ⁴⁸ . Сначала были получены карты с низким увеличением при 135-кратном увеличении, чтобы найти ламели, затем были получены карты со средним увеличением (MMM) при 8700-кратном увеличении для корреляции и идентификации участков для получения TS при 26000 × или 33000 × (соответствующие размеры пикселей на уровне образца: 3,356 и 2,671 Å соответственно). TS были получены с использованием дозосимметричной схемы ⁴⁹ с постоянной дозой электронов прибл. 3 e ^— / Å ² на каждую проекцию, расфокусировка цели −5 мкм, щель энергетического фильтра при 20 эВ, охват диапазона от 60 ° до −60 ° с шагом 3 °.Томография на ламелях выполнялась на столике, наклоненном на 6 °, чтобы компенсировать предварительный наклон ламели по отношению к сетке. Каждая проекция была получена в режиме счета с использованием фракционирования дозы и 20-40 отдельных кадров, которые были выровнены и суммированы с помощью плагина SEMCCD в SerialEM. Томографию всей клетки выполняли, как указано выше, за исключением того, что TS получали при увеличении 33000 × (размер пикселя на уровне образца: 4,302 Å) с использованием прямого электронного детектора K2 вместо прямого электронного детектора K3.

ТС обработано с использованием пакета IMOD ⁵⁰ . TS были выровнены с использованием патч-трекинга. Перед реконструкцией функция передачи контраста была скорректирована путем переворота фазы, а микрофотографии подверглись дозовой фильтрации. Томограммы были восстановлены с использованием алгоритма взвешенной обратной проекции с фильтром типа SIRT, эквивалентным десяти итерациям. Для спектрального анализа мощности на рис. 1 томограммы были восстановлены с использованием алгоритма SIRT, реализованного в 3dmod.

3D-рендеринг реконструированных томограмм

Рендеринг создан в Amira 2019.3 (ThermoFisher Scientific). Сначала был применен фильтр улучшения мембраны. С помощью инструмента сегментации Top Hat был создан первый 3D-рендеринг. На основе этой исходной модели все мембраны были сегментированы вручную.

Среднее значение субтомограммы

STA было выполнено в Dynamo ³³ . Частицы ( n = 116) были собраны вручную на 2 томограммах, и 100 воксельных субтомограмм были извлечены с использованием функции «обрезка на стене» с начальной ориентацией частиц, назначенной перпендикулярно сегментированной ограничивающей мембране LB.Первоначальный эталон был создан путем усреднения всех 105 частиц, а среднее значение итеративно уточнялось с использованием маски в форме полукупола. Сканирование симметрии выполнялось с использованием сфокусированной маски на верхней части узла клетки. Впоследствии среднее значение было дополнительно уточнено с использованием симметрии C ₈ .

Рабочий процесс посткорреляционной корреляции на ламелях

После витрификации флуоресцентно меченных клеток путем замораживания в погружной камере сетки были нанесены на карту на Leica cryo-LM. Сетка была перенесена на двухлучевой крио-FIB / SEM.Посредством корреляции с низкой точностью флуоресцентной карты MIP с картой SEM сетки, представляющие интерес клетки были отобраны и подвергнуты FIB-измельчению. После второй передачи образца на крио-ТЕМ 300 кВ были нанесены на карту ламели, были выбраны интересующие области и были получены TS. Чтобы облегчить посткорреляцию ламелей с высокой точностью, сетки были восстановлены после получения крио-ЭТ, и ламели были картированы во второй раз в крио-LM, чтобы выявить точное положение ламелей на сетке.Чтобы объединить флуоресцентный сигнал с первой крио-LM-карты с информацией о положении ламелей на второй крио-LM-карте, деконволюционные стеки были зарегистрированы в MATLAB 2018b (MathWorks) с использованием функции imregtform с настраиваемым скриптом (см. Раздел «Доступность кода»). Жесткая матрица преобразования, включающая перенос и вращение, была рассчитана на основе одного и того же флуоресцентного канала обеих крио-LM карт соответственно. Остальные каналы, включая TL-BF из второй крио-LM-карты, были преобразованы с применением рассчитанной матрицы преобразования.Флуоресцентные каналы первой крио-LM-карты были объединены с преобразованным каналом TL-BF второго крио-LM в FIJI / ImageJ и сохранены как составной TIF. Чтобы компенсировать угол фрезерования FIB, композитный пакет был повторно разрезан с помощью FIJI / ImageJ. Используя канал TL-BF, был измерен фактический наклон ламелей в штабеле, и составной штабель был повернут соответствующим образом для компенсации наклона. Z-срез ламеллы был идентифицирован и извлечен после второго повторного среза в FIJI / ImageJ.Этот единственный срез со скорректированным наклоном коррелировали со сшитой TEM-картой с использованием нежесткого 2D преобразования в ec-CLEM ⁵¹ с использованием четырех углов ламеллы, а также четко идентифицируемых флуоресцентно меченых органелл, таких как LD, в качестве ориентиров.

Анализ корреляционной точности

Для оценки корреляции и точности X – Y рабочего процесса крио-CLEM после корреляции на ламелях была проанализирована окончательная корреляция карт MMM и крио-LM. Локальные максимумы крио-LM-карты были рассчитаны с помощью FIJI / ImageJ с использованием порога допуска 10.Для каждого локального максимума ультраструктуры коррелированного MMM в сферической области (радиус = 1 мкм) были классифицированы как LD, LB или мембраносвязанные органеллы (MVB, ER и пузырьки). Митохондриальные или ядерные мембраны, а также участки без каких-либо мембраносвязанных структур были классифицированы как неспецифические. Для каждой назначенной ультраструктуры были измерены расстояние и угол до центра локального максимума и нанесены на график в виде радиолокационного графика для оценки точности корреляции.

Конфокальная флуоресцентная микроскопия

Конфокальная микроскопия клеток A549, трансфицированных ABCA3-eGFP, была проведена с использованием лазерного сканирующего конфокального микроскопа SP8 TCS (Leica), оборудованного 63 × 1.Масляный иммерсионный объектив 4 NA и камера контроля микроклимата, нагретая до 37 ° C. Анализ изображений был выполнен в ImageJ / FIJI ⁴⁷ . Автоматическая трехмерная сегментация структур ABCA3-eGFP была выполнена в Imaris 9.5.1 (Bitplane) после деконволюции в AutoQuant X3.1 (Media Cybernetics).

Статистика и воспроизводимость

Рабочий процесс был оптимизирован на нескольких испытаниях. Представленные данные получены из двух независимых биологических повторов. Оценка размера выборки не производилась.Структуры, соответствующие изолированным сигналам ABCA3-eGFP ( n = 62), были разделены на шесть ламелей. Доступны исходные данные, содержащие измерения и количественные оценки (Дополнительные данные 1).

Дополнительная информация

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить доктора Сурафеля Мулугета за любезно предоставленную плазмиду hABCA3-eGFP и профессора доктора Ханса-Георга Кройсслиха за предоставление клеток HSAEpC. Мы благодарим д-ра Стефана Пфеффера за критическое прочтение рукописи и д-ра Штефана Пфеффера.Бен Энгель и доктор Ларс Андерс Карлсон за плодотворное обсуждение OMDP. Мы хотели бы поблагодарить платформу визуализации инфекционных заболеваний (IDIP) за поддержку микроскопии Центра интегративных исследований инфекционных заболеваний Гейдельберга. Мы хотели бы отметить доступ к инфраструктуре и поддержку, предоставляемую Cryo-EM Network в Гейдельбергском университете (HDcryoNet). Это исследование финансировалось за счет исследовательского гранта Фонда Чики и Хайнца Шаллер (Программа руководителей исследовательской группы Шаллера) и Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Немецкий исследовательский фонд) Projektnummer 240245660 SFB 1129.

Вклад авторов

Подготовка образца: S.K., B.H.W., S.L.W., A.K. и P.C. концептуализация и дизайн исследования: S.K., B.H.W., V.L. и P.C .; сбор данных: S.K., B.H.W., S.L.W., A.K. и P.C .; анализ: S.K., B.H.W., S.L.W., V.L. и P.C., подготовка статьи: S.K., B.H.W., S.L.W. и P.C.

Финансирование

Финансирование в открытом доступе, организованное Projekt DEAL.

Доступность данных

Данные EM представлены в базе данных EMDB под номерами доступа: EMD-10818, EMD-10819, EMD-10820, EMD-10821, EMD-11929 и EMD-11931.Исходные данные предоставлены вместе с этой статьей.

Доступность кода

Макрос FIJI / ImageJ для сборки флуоресцентных карт и код MATLAB, используемый для регистрации трехмерного стека, доступен на GitHub по адресу https://github.com/chlanda-lab.

Конкурирующие интересы

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Сноски

Примечание издателя Springer Nature сохраняет нейтралитет в отношении юрисдикционных претензий в опубликованных картах и ​​о принадлежности к учреждениям.

Эти авторы внесли одинаковый вклад: Штеффен Кляйн, Бенедикт Х. Виммер.

Дополнительная информация

Дополнительная информация Онлайн-версия содержит дополнительные материалы, доступные по адресу 10.1038 / s42003-020-01567-z.

Ссылки

1. Шмитц Г., Мюллер Г. Структура и функция ламеллярных телец, липид-белковых комплексов, участвующих в хранении и секреции клеточных липидов. J. Lipid Res. 1991; 32: 1539–1570. DOI: 10.1016 / S0022-2275 (20) 41642-6.[PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 2. Дэниэлс CB, Оргейг С. Легочный сурфактант: ключ к эволюции дыхания воздухом. N. Physiol. Sci. 2003. 18: 151–157. [PubMed] [Google Scholar] 3. Фесслер МБ, Лето RS. Липиды поверхностно-активных веществ на границе раздела «хозяин-окружающая среда». метаболические сенсоры, супрессоры и эффекторы воспалительных заболеваний легких. Являюсь. J. Respir. Cell Mol. Биол. 2016; 54: 624–635. DOI: 10.1165 / rcmb.2016-0011PS. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 4. Эррера-Рамос Э. и др.Генетические варианты поверхностно-активного белка А связаны с тяжелой респираторной недостаточностью при инфекции вирусом пандемического гриппа А. Крит. Забота. 2014; 18: R127. DOI: 10.1186 / cc13934. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 5. Glasser SW и др. Мыши с дефицитом поверхностно-активного протеина С восприимчивы к респираторно-синцитиальной вирусной инфекции. Являюсь. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 2009; 297: L64–72. DOI: 10.1152 / ajplung..2008. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 6. Флорос Дж., Томас Нью-Джерси.Генетика поверхностно-активных белков при внебольничной пневмонии: балансировка воспалительного состояния хозяина. Крит. Забота. 2011; 15: 156. DOI: 10.1186 / cc10115. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 7. Виейра Ф., Кунг Дж. В., Бхатти Ф. Структура, генетика и функция легочных ассоциированных сурфактантных белков A и D: внелегочная роль этих лектинов типа C. Анна. Анат. 2017; 211: 184–201. DOI: 10.1016 / j.aanat.2017.03.002. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 8. Лет-Ларсен Р., Чжун Ф., Чоу В. Т., Холмсков Ю., Лу Дж.Спайк-гликопротеин коронавируса SARS избирательно распознается легочным сурфактантным белком D и активирует макрофаги. Иммунобиология. 2007; 212: 201–211. DOI: 10.1016 / j.imbio.2006.12.001. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 9. Вудс П.С. и др. Смертельная инфекция вируса гриппа А h2N1 изменяет липидом сурфактанта альвеолярных клеток II типа. Являюсь. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 2016; 311: L1160 – L1169. DOI: 10.1152 / ajplung.00339.2016. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 10.Sun X и др. Метаболизм жирных кислот связан с тяжестью заболевания после инфицирования H7N9. EBioMedicine. 2018; 33: 218–229. DOI: 10.1016 / j.ebiom.2018.06.019. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 11. Охс М. Чем ближе мы смотрим, тем больше видим? Количественный микроскопический анализ системы легочных сурфактантов. Cell Physiol. Biochem. 2010; 25: 27–40. DOI: 10,1159 / 000272061. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 12. Grathwohl C, Newman GE, Phizackerley PJ, Town MH. Структурные исследования пластинчатых осмиофильных тел, выделенных из легкого свиньи.Результаты 31P ЯМР и содержание воды. Биохим. Биофиз. Acta. 1979; 552: 509–518. DOI: 10.1016 / 0005-2736 (79)

-0. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 13. Вурхаут В.Ф., Уивер Т.Э., Хаагсман Х.П., Гейз Х.Дж., Ван Голд Л.М. Биосинтетическая маршрутизация белков легочного сурфактанта в клетках альвеолярного типа II. Microsc. Res. Tech. 1993; 26: 366–373. DOI: 10.1002 / jemt.1070260504. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 14. Hobi N, et al. Маленький ключ открывает тяжелую дверь: основная функция небольших гидрофобных белков SP-B и SP-C — запускать адсорбцию легочных пластинчатых тел сурфактанта.Биохим. Биофиз. Acta. 2016; 1863: 2124–2134. DOI: 10.1016 / j.bbamcr.2016.04.028. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 15. Mulugeta S, et al. Идентификация LBM180, мембранного белка, ограничивающего ламеллярные тела альвеолярных клеток типа II, в качестве белка-переносчика ABC ABCA3. J. Biol. Chem. 2002; 277: 22147–22155. DOI: 10.1074 / jbc.M201812200. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 16. Мацумура Ю., Сакаи Х., Сасаки М., Бан Н., Инагаки Н. Поглощение холин-фосфолипидов, опосредованное ABCA3, во внутриклеточные везикулы в клетках A549.FEBS Lett. 2007. 581: 3139–3144. DOI: 10.1016 / j.febslet.2007.05.078. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 17. Перес-Гил Дж. Структура легочных мембран и пленок сурфактанта: роль белков и липид-белковые взаимодействия. Биохим. Биофиз. Acta. 2008; 1778: 1676–1695. DOI: 10.1016 / j.bbamem.2008.05.003. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 18. Vanhecke D, et al. Пересмотр ультраструктуры пластинчатого тела: замораживание под высоким давлением и криоэлектронная микроскопия срезов стекловидного тела. Histochem. Cell Biol.2010. 134: 319–326. DOI: 10.1007 / s00418-010-0736-4. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 19. Аль-Амуди А., Студер Д., Дубочет Дж. Режущие артефакты и процесс резки в срезах стекловидного тела для криоэлектронной микроскопии. J. Struct. Биол. 2005; 150: 109–121. DOI: 10.1016 / j.jsb.2005.01.003. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 20. Rigort A, et al. Микрообработка эукариотических клеток сфокусированным ионным пучком для криоэлектронной томографии. Proc. Natl Acad. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ. 2012; 109: 4449–4454. DOI: 10.1073 / pnas.1201333109. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 21.Марко М., Се Си, Шалек Р., Франк Дж., Маннелла С. Разжижение замороженных гидратированных биологических образцов с помощью фокусированного ионного пучка для криоэлектронной микроскопии. Nat. Методы. 2007; 4: 215–217. DOI: 10,1038 / nmeth2014. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 22. Кукульский В. и др. Коррелированная флуоресценция и трехмерная электронная микроскопия с высокой чувствительностью и пространственной точностью. J. Cell Biol. 2011; 192: 111–119. DOI: 10.1083 / jcb.201009037. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 23. Schorb M, Briggs JA. Коррелированная криофлуоресценция и криоэлектронная микроскопия с высокой пространственной точностью и повышенной чувствительностью.Ультрамикроскопия. 2014; 143: 24–32. DOI: 10.1016 / j.ultramic.2013.10.015. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 24. Мецкас Л.А., Бриггс Я.Г. Основанное на флуоресценции определение состояния слияния мембран на крио-ЭМ сетке с использованием коррелированной криофлуоресценции и криоэлектронной микроскопии. Microsc. Микроанал. 2019; 25: 942–949. DOI: 10.1017 / S1431

06. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 25. Сартори-Рупп А. и др. Корреляционная криоэлектронная микроскопия выявляет структуру TNT в нейрональных клетках.Nat. Commun. 2019; 10: 342. DOI: 10.1038 / s41467-018-08178-7. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 26. Плитцко Ю.М., Ригорт А., Лейс А. Корреляционная крио-световая микроскопия и криоэлектронная томография: от клеточных территорий до молекулярных ландшафтов. Curr. Opin. Biotechnol. 2009; 20: 83–89. DOI: 10.1016 / j.copbio.2009.03.008. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 27. Schellenberger P, et al. Высокоточная корреляционная флуоресцентная и электронная криомикроскопия с использованием двух независимых маркеров совмещения.Ультрамикроскопия. 2014; 143: 41–51. DOI: 10.1016 / j.ultramic.2013.10.011. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 28. Хэмптон С.М. и др. Коррелированная флуоресцентная микроскопия и криоэлектронная томография инфицированных вирусом или трансфицированных клеток млекопитающих. Nat. Protoc. 2017; 12: 150–167. DOI: 10.1038 / nprot.2016.168. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 29. Арнольд Дж и др. Пробоподготовка криофокусированного ионного пучка в зависимости от места проведения под контролем трехмерной корреляционной микроскопии. Биофиз. Дж.2016; 110: 860–869. DOI: 10.1016 / j.bpj.2015.10.053. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 30. Wilfling F, et al. Селективный путь аутофагии для фазовых отложений эндоцитарных белков. Мол. Клетка. 2020; 80: 764–778..e7. DOI: 10.1016 / j.molcel.2020.10.030. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 31. Либер М., Смит Б., Сакаль А., Нельсон-Рис В., Тодаро Г. Непрерывная линия опухолевых клеток из карциномы легкого человека со свойствами альвеолярных эпителиальных клеток типа II. Int.J. Рак. 1976; 17: 62–70. DOI: 10.1002 / ijc.20110. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 32. Wolff G, et al. Не забывайте о зазоре: швы с микродомпенсированием значительно уменьшают изгиб крио-ламелей, изготовленных фрезерованием FIB. J. Struct. Биол. 2019; 208: 107389. DOI: 10.1016 / j.jsb.2019.09.006. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 33. Castano-Diez D, Kudryashev M, Arheit M, Stahlberg H. Dynamo: гибкий и удобный инструмент разработки для усреднения субтомограмм крио-ЭМ данных в высокопроизводительных вычислительных средах.J. Struct. Биол. 2012; 178: 139–151. DOI: 10.1016 / j.jsb.2011.12.017. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 34. Купер Дж. Р. и др. Долгосрочное культивирование линии раковых клеток A549 способствует формированию многослойных телец и дифференцировке по фенотипу пневмоцитов альвеолярного типа II. PLoS ONE. 2016; 11: e0164438. DOI: 10.1371 / journal.pone.0164438. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 35. Gorelick, S. et al. PIE-область, интегрированный криокорреляционный свет и микроскопия FIB / SEM. Элиф 10.7554 / eLife.45919 (2019). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] 36. Кришнамурти Дж., Ван CY, Штайер Дж., Уилсон Д.Л. Удаление подповерхностной флуоресценции при криоизображении с помощью деконволюции. Опт. Выражать. 2010; 18: 22324–22338. DOI: 10.1364 / OE.18.022324. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 38. Вольф Г., Хаген С., Грюневальд К., Кауфманн Р. К корреляционной флуоресценции сверхвысокого разрешения и электронной криомикроскопии. Биол. Клетка. 2016; 108: 245–258. DOI: 10.1111 / boc.201600008. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 39.Haller T, Cerrada A, Pfaller K, Braubach P, Felder E. Микроскопия в поляризованном свете выявляет физиологические и вызванные лекарствами изменения в сборке сурфактантной мембраны в пневмоцитах альвеолярного типа II. Биохим. Биофиз. Acta Biomembr. 2018; 1860: 1152–1161. DOI: 10.1016 / j.bbamem.2018.01.010. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 40. Махамид Дж. И др. Жидкокристаллические фазовые переходы в липидных каплях связаны с клеточными состояниями и специфической ассоциацией органелл. Proc. Natl Acad. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ. 2019; 116: 16866–16871.DOI: 10.1073 / pnas.12116. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 41. Engelbrecht S, Kaltenborn E, Griese M, Kern S. Липидный переносчик сурфактанта ABCA3 расщепляется на N-конце внутри LAMP3-положительных везикул. FEBS Lett. 2010. 584: 4306–4312. DOI: 10.1016 / j.febslet.2010.09.026. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 42. Bhowmick R, et al. Трехмерная тканевая модель легких человека для изучения инфекции гриппа А. Tissue Eng. Часть A. 2018; 24: 1468–1480. DOI: 10,1089 / десять.tea.2017.0449. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 43. Чжан Л. и др. Rab38 нацеливается на ламеллярные тела и нормализует их размеры в эпителиальных клетках альвеолярного типа II легких. Являюсь. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 2011; 301: L461–477. DOI: 10.1152 / ajplung.00056.2011. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 44. Tanaka H, ​​et al. Структура свода печени крысы с разрешением 3,5 ангстрем. Наука. 2009. 323: 384–388. DOI: 10.1126 / science.1164975. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 45.Раст А. и др. Биогенные участки тилакоидов цианобактерий образуют участки контакта с плазматической мембраной. Nat. Растения. 2019; 5: 436–446. DOI: 10.1038 / s41477-019-0399-7. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 46. Прейбиш С., Заальфельд С., Томанчак П. Оптимальное сшивание мозаичных трехмерных изображений при получении микроскопических изображений. Биоинформатика. 2009. 25: 1463–1465. DOI: 10.1093 / биоинформатика / btp184. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 48. Mastronarde DN. Автоматизированная электронно-микроскопическая томография с надежным предсказанием движений образца.J. Struct. Биол. 2005. 152: 36–51. DOI: 10.1016 / j.jsb.2005.07.007. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 49. Хаген WJH, Ван W, Бриггс JAG. Реализация схемы наклона криоэлектронной томографии, оптимизированной для усреднения субтомограмм высокого разрешения. J. Struct. Биол. 2017; 197: 191–198. DOI: 10.1016 / j.jsb.2016.06.007. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 50. Мастронарде DN, Held SR. Автоматическое совмещение серии наклона и томографическая реконструкция в IMOD. J. Struct. Биол. 2017; 197: 102–113.DOI: 10.1016 / j.jsb.2016.07.011. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 51. Поль-Гиллото П. и др. eC-CLEM: гибкое программное обеспечение для многомерной регистрации для корреляционных микроскопий. Nat. Методы. 2017; 14: 102–103. DOI: 10,1038 / Nmeth.4170. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Произошла ошибка при настройке вашего пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

---

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, используйте кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
• Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

---

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

---

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

3D-аддитивные композитные каркасы с пластинчатыми наполнителями, содержащими антибиотики, для профилактики костных инфекций и регенерации тканей

https: // doi.org / 10.1016 / j.bioactmat.2020.09.031Получить права и контент

Основные моменты

•

Матрицы, элюированные антибиотиками, обрабатываются методом экструзии из расплава при высокой температуре.

•

Неорганические пластинчатые наполнители, диспергированные в каркасе, несут антибиотики.

•

Антибиотики выделяются посредством ионного обмена контролируемым и настраиваемым образом.

•

Антибиотики сохраняют свою активность после процесса высокотемпературной печати.

•

Мезенхимальные стромальные клетки человека подвергаются остеогенной дифференцировке на каркасе.

Abstract

Инфекции костей после открытого перелома кости или операции на имплантате остаются проблемой в области ортопедии. Чтобы избежать системного введения высоких доз лекарств, необходимо оптимальное местное высвобождение антибиотиков из каркасов. Каркасы, изготовленные с помощью 3D-аддитивов (AM), изготовленные из биоразлагаемых полимеров, идеально подходят для поддержки заживления костей в сценариях, не связанных с сращением, и могут иметь антимикробные свойства за счет включения антибиотиков.В этом исследовании ципрофлоксацин и гентамицин, интеркалированные в межламеллярных пространствах двойных гидроксидов магния и алюминия (MgAl) и α-циркония фосфатов (ZrP), соответственно, диспергируются в термопластичном полимере путем компаундирования в расплаве и затем обрабатываются посредством высокотемпературной экструзии из расплава AM. (~ 190 ° C) в 3D-каркасы. Неорганические наполнители обеспечивают длительное высвобождение антибиотиков через полимерную матрицу, контролируемое обменом противоионов антибиотиков или условиями pH.Важно отметить, что оба антибиотика сохраняют свою функциональность после производственного процесса при высоких температурах, что подтверждается их активностью против штаммов Gram + и Gram — бактерий. Более того, каркасы, нагруженные наполнителем-антибиотиком, не нарушают остеогенную дифференцировку мезенхимальных стромальных клеток человека, обеспечивая минерализацию матрикса и экспрессию соответствующих остеогенных маркеров. В целом, эти результаты предполагают возможность изготовления трехмерных каркасов с двойной функциональностью посредством высокотемпературной экструзии из расплава для регенерации кости и предотвращения инфекций.

Ключевые слова

Производство добавок для экструзии расплава

Доставка антибиотиков

Пластинчатые неорганические наполнители

Костная инфекция

Костная регенерация

Мезенхимальные стромальные клетки человека

000 Рекомендуемые статьи Авторы

© 2020 92. Издательские услуги Elsevier B.V. от имени KeAi Communications Co. Ltd.

Рекомендуемые статьи

Цитирующие статьи

пластинчатый графит — итальянский перевод — Linguee

Ковкий чугун […] промежуточный продукт bet we e n пластинчатый графит i r на (серый чугун) и […] Сталь литая. eur-lex.europa.eu	La ghisa malleabile è un prodotto […] intermedio t ra la ghis a a grafite l amellare ( ghi sa gr или ia) e […] l’acciaio fuso. eur-lex.europa.eu
Выражение […] «Не податливый», включая ud e s пластинчатый графит c a st железо. eur-lex.europa.eu	Il termine «ghisa non » […] malleabile »comp re nde anche la ghi sa a grafite l amellare . eur-lex.europa.eu
Серый чугун […] представляет собой чугун wi t h пластинчатый графит i n a куб. с DIN 1691. blickle.ee	La ghisa grigia è […] di tipo a cciai oso co n графитовая пластина sec ond o la n orma DIN 1691. blickle.it
Для железнодорожной промышленности, ветряных электростанций и трубопроводной арматуры мы предлагаем два других вида чугунов: серый чугун с шаровидным графитом EN-GJS 400-18 LT, имеющий удлинение более 18% и соответствующую ударную вязкость. низкий […] температуры (до -20 ° С), а также […] серый чугун wi t h пластинчатый графит a l lo люминофор […] , отвечающий стандартам на продукцию железнодорожного транспорта. livar.si	Per l’industria ferroviaria e per l’industria delle centrali eoliche e per le armature offriamo altri due tipi di ghisa: la ghisa grigia sferoidale EN-GJS 400-18 LT il cui coefficiente di dilatazione a basse temperature (Fino a –20 ° В) супера il 18% ed и dotata […] di una resistenza adatta, nonché […] la gh is a gri gia co n grafite l amellare , t empra ta con il […] fosforo che rientra nei prodotti standard per le ferrovie. livar.si
Чугун с шаровидным графитом — это серый чугун с шаровидным графитом. Он отличается от […] серый чугун wi t h пластинчатый графит i n i ts химический состав, […] просто потому, что помимо базового […] элементов, он также содержит небольшое количество магния (от 0,04 до 0,06%), церия и редкоземельных элементов, влияющих на формирование графитовых сфер. livar.si	La ghisa nodulare è una ghisa grigia c on grafite sf erica la cui composizione chimica si diffnzia da quella […] della ghi sa grig ia con grafite lamellare so lo per i l fatto […] Che oltre agli elementi […] fondamentali, contiene anche piccole Quantità di Magnesio (от 0,04 до 0,06%), pietre e terriccio raro che influiscono sulla formazione delle sfere di grafite. livar.si
Тот факт, что магний добавляется в процессе производства […] отливка из высокопрочного литья […] изменения железа t h e графит s t ru cture from f la k e o s pheroidal […] и дает ему другое механическое […] свойств, таких как определенная деформируемость при напряжении сжатия. eur-lex.europa.eu	L’aggiunta di magnesio durante il processo di produzione dei […] pezzi fusi di ghisa duttile […] cambia la s tr uttur a d ell a grafite da lamellare a sf ero idale e conferisce […] proprietà meccaniche разнообразный, […] имеет определенную деформацию и сжатие. eur-lex.europa.eu
Благодаря многолетнему опыту компания […] выполняет с осторожностью и […] точность, кривизна e o f пластинчатый a n d массив дерева в каждом […] сущность и размер, что составляет обширную […] ассортимент готовой продукции для интерьера и экстерьера. archiproducts.com	Grazie all’esperienza acquisita nel corso degli anni, la ditta […] esegue, con massima cura e precisione, la […] curvatu ra del leg no lamellare e mass ello i n ogni […] essenza ed ogni sizesione, realizzando […] una обширная гамма продуктов lavorati per esterni ed interni. archiproducts.com
Он состоит из организованных базальных, остистых и зернистых слоев и […] многослойный роговой слой […] содержащий межэлемент ul a r пластинчатый l i pi d слои, расположенные […] по образцам, аналогичным найденным in vivo. eur-lex.europa.eu	Il modello è costituito da uno strato basale, uno strato spinoso e uno strato granulosoorganzati e da […] uno strato corneo multiplo contenente […] stra ti di s tru ttu re lamellari li pid ich e int er celli […] размещается в моде аналогично quelle presenti in vivo. eur-lex.europa.eu
2.10 Стандарты и проверка оценки рисков в сложных средах могут различаться между оценками in vitro и in situ: исследования в этой области (6) должны выходить за рамки обычных защитных продуктов, таких как фильтры, дыхательные маски, защитные […] одежда и перчатки — эти изделия имеют […] был протестирован wi t h графит n a no частицы […] длиной от 10 до 50 нанометров. eur-lex.europa.eu	2.10 Стандарт и проверка ценности в условиях окружающей среды, возможные варианты изменения стоимости «in vitro» и «in situ»: le ricerche in proposito (6) dovrebbero and are oltre i prodotti protettivi Традиционные, come Filri, cartucce […] респираторы, abbig охраной протяженности, guanti: oggetti, questi, testati con […] nanopa rt icell e d i grafite, lun ghe 1 0- 50 нанометров. eur-lex.europa.eu
Наружная рама из многослойной ткани ye r , пластинчатая u n id бук прямая; […] размер секции 60х30 мм. lordflex.com	Telaio perimetrale […] in fagg io mul tist ra ti lamellare, u ni dire zion al e, sizesione […] серия 60×30 мм. lordflex.com
Материал Внешний кожух, ручка, гайки и болты, двигатель и кожух вала из нержавеющей стали; патрубок, двигатель и центральная крышка корпуса из латуни; рабочие колеса и диффузоры из армированного стекловолокном […] noryl®, сертифицировано для питья […] воды; механическое море л i n графит a n d керамический со смазкой […] камера; асинхронный двигатель […] с ротором в коротком замыкании на шарикоподшипниках. tubi.net	Materiale Involucro esterno, impugnatura, bulloneria, Involucro motore ed albero in acciaio inox; bocchettone, coperchio motore e corporation centrale в оттоне; giranti e diffusori in noryl® rinforzato con fibra di […] vetro, сертификат на acque potabili; […] tenut a mecc anic a in grafite e ce rami ca c на камере […] di lubrificazione; мотор asincrono […] con rotore in corto circuito montato su cuscinetti a sfera. tubi.net
С компенсационным режимом или работой с одиночными колоннами, а также […] как для стеклянных вставок в форсунке и […] в детекторе t h e графит s e al s согласно разделу […] 5.5 должны использоваться. eur-lex.europa.eu	Операция с системой компенсации для отдельного столбца, чистая согласно […] gli insert di vetro nell’iniettore e nel rivelatore, si devono […] usare le gu arniz ion i d i grafite s eco ndo la s ez ione 5.5. eur-lex.europa.eu
Поскольку уровень сотрудничества был высоким (100% экспорта соответствующего продукта из Индии в Сообщество), остаточная временная демпинговая маржа была установлена ​​на уровне наивысшего . […] Установлена ​​демпинговая маржа для сотрудничающей компании, то есть […] уровень установлен f o r Graphite I n di a Limited, а именно 34,3%. eur-lex.europa.eu	Poiché il livello di corazione era alto (100% delle esportazioni del prodotto in esame dall’India alla Comunità), маржинальный остаток демпинга и стато фисса в via provvisoria al livello del margine di dumping più […] Elevato Stabilito per una delle società che ha Collaborato, оссия аль […] livello s ta bili to p er la Graphite Ind ia Lim ited ( 34,3%). eur-lex.europa.eu
Благодаря смоле и спе ci a l пластинчатый p i gm ents, содержащиеся в […] Продукт , Murisol гарантирует высокую воздухопроницаемость, лучше […] Стойкость цвета и меньшее количество слоев во время цикла окраски. caparreghini.it	За тип […] resina e dei partolari pigm enti lamellari in e sso co ntenuti […] assicura una elevata traspirabilità, una maggiore […] resistenza del colore ed un risparmio di strati nel ciclo di pitturazione. caparreghini.it
Непрозрачная краска для внутренних стен с хорошими герметизирующими свойствами, моющаяся, […] состоит из пигм en t , пластинчатый c h ar ges и акрил […] Эмульсия смолы . caparreghini.it	Pittura murale opaca coprente con funzione изолированно, per interno, lavabile, composta […] da pigm en to, c ari ch e lamellari e r esi na ac ri lica in […] эмульсия. caparreghini.it
ОПИСАНИЕ: DEGA PLASTIC представляет собой соединение […] пигменты, м ic r o — пластинчатый a n d волокнистые заряды, […] кварцевых наполнителей, связанных с сополимером […] Смола , обладающая хорошей связывающей способностью, пропускающая водяной пар и устойчивая к УФ-излучению. лучи. gobbetto.com	ОПИСАНИЕ: DEGA PLASTIC — это соединение […] pigmenti, cari ch e microlamellari e f ibrose, […] наполнитель Quarziferi Legati ad una Resina Copolimera […] modificata, dotata di ottimo potere legante, traspirante al vapore acqueo e resistente ai raggi u.Версия gobbetto.com
Четыре основных подразделения группы: Moretti Contract, которое занимается управлением крупными работами под ключ, Moretti Prefabricate, которое разрабатывает сборные конструкции из бетона, Moretti Interholz, у которого […] была среди первых компаний в Италии […] для работы в t h e пластинчатый w o od рабочий, Moretti […] Недвижимость продвигающая, девелоперская […] и занимается инициативами в сфере недвижимости. admnetwork.it	Главное подразделение группы: Moretti Contract, который является атрибутом управления большими проектами в мире. Moretti Prefabbricati che sviluppa soluzioni prefabbricate in calcestruzzo, Moretti Interholz che è stata tra le prime […] aziende in Italia ad operare nella […] lavorazion e del le gno lamellare , Mo rett i Real Estate […] che promuove, sviluppa e gestisce iniziative immobiliari. admnetwork.it
Помимо катодной защиты от коррозии, они […] обеспечить — за счет t he i r пластинчатый s t ru cture — дополнительный […] барьерный эффект в порошке […] покрывающая пленка, что приводит к значительному снижению проницаемости для коррозионных агентов. eckart.net	Показать объявление о защите прав человека […] Corroe Catodica, Forniscono, Grazie […] alla l or o str utt ura lamellare, un ef fetto b arriera, […] riducendo la permeabilità del rivestimento agli Agentti Corrosivi. eckart.it
И наоборот, как окончательная компенсационная пошлина […] для Hindustan Ele ct r o Графит ( H EG ) Limited ниже […] , чем предварительная компенсация […] , суммы, временно обеспеченные сверх окончательной ставки компенсационных пошлин, должны быть освобождены. eur-lex.europa.eu	Per contro, poiché il dazio Compensativo Definitivo […] per la H в dusta n E lec tro Графит (HE G) Lim ited è inferiore […] Аль-Дазио Компенсативо Провизорио, […] импортированных депозита в через провизорскую проверку, не имеющую отношения к определенному количеству компенсационных выплат. eur-lex.europa.eu
(2) на […] запрос Hindustan Ele ct r o Графит L i mi ted (‘HEG’ или ‘the […] компания ‘), индийский производитель-экспортер субъект […] к действующим антидемпинговым мерам, частичный промежуточный пересмотр вышеупомянутого Постановления был инициирован в соответствии со Статьей 11 (3) Основного Постановления. eur-lex.europa.eu	(2) Su richiesta di H in dust an E le ctro Graphite Limi te d (H EG o « la società»), […] un produttore esportatore indiano soggetto […] все активные антидемпинговые действия, статус аперто un riesame intermedio parziale del citato regolamento, ai sensi dell’articolo 11, paragrafo 3, del regolamento di base. eur-lex.europa.eu
Мы предлагаем Вам не только релевантную […] результаты поиска f o r Графит . industrystock.net	Non vi forniamo solo le voci di ricerca più […] rileva nt i ri guar do a Grafite . industrystock.it
5 ноября 2010 г. Европейская комиссия (Комиссия) […] поступила жалоба […] в отношении предполагаемого вредного сброса cer ta i n графит e l ec trode syst em s e l ec trodes), происходящие из Китайской Народной Республики (Китай), поданные в соответствии со Статьей 5 Основного Регламента Европейским Углеродом a n d Графит A s , так что связь (истец) от имени производителей, представляющих основную долю, в данном случае более 50%, от общего объема производства Союза, Cer ta i n графит e l ec trodes systems. eur-lex.europa.eu	Il 5 novembre 2010 la Commissione europea («la Commissione») ha risvuto una denuncia riguardante il presunto pregiudizio causato dalle […] importazioni в самосвале di […] alcuni sistemi di elet tr odi d i grafite ( «ele ttro di d i grafite» ) или ig inari della Repub представлены в соответствии со всеми артикулами 5 базовых данных по Eur по и C arb по и Graphite Ass oci ATI по (« » или или Conto di produttori che rappresentano unacentuale рассмотрение, в этом случае caso superiore al 50%, della produzione total dell’Unione di alcuni sistemi d i elett стержень id i grafite. eur-lex.europa.eu
Каркас кровати mad e o f пластинчатый , u ni направленный многослойный […] натуральный бук для обеспечения отличной стойкости к […] сильное давление на продольные доски. lordflex.com	Il telaio delle reti è costituito da faggio […] naturale m ulti stra to lamellare un idir ezio na le, per […] Offrire, Attackverso la Massima Coesione […] delle fiber di legno, una resistenza migliore all forti spinte che insistono sui longaroni. lordflex.com
Здания построены с особым вниманием к […] экологичность во многих областях, например, […] строительные материалы al s ( пластинчатый w o od , натуральные камни), […] воздействие на окружающую среду (медь […] крыш, которые сочетаются с зеленью, деревянными облицовками, деревянными дверными и оконными рамами) и энергопотреблением (все окна защищены от прямого излучения, чтобы сократить использование кондиционирования воздуха летом; все здания оснащены теплоизоляция, на всех кровлях установлена ​​фотоэлектрическая система). canadoclub.it	Le costruzioni sono State Realizzate Con la Massima Attenzione all’ecocompatibilità, […] sia sotto il profilo dei materiali […] da co st ruzio ne utilizzati (l egno lamellare, pie tr e naturali), […] sia per l’inserimento ambientale […] (тетти в раме че си интеграно аль верде делла вегетация, параменти в леньо, инфисси в леньо), sia per i consumi energetici (все ветерация звукового сопровождения, направленная на consentire ridotto uso del condatiizionamento estivo, i fabbric ди каппотто термико, фотоэлектрические и статические установки на все диафрагмы). canadoclub.it
Тип Одноцилиндровый, 2-тактный, […] жидкостное охлаждение le d , пластинчатый i n du ction в […] блок-картер betamotor.it	Tipo M onocilindrico, 2 температуры, raffreddato a […] жидкость o, ammi ssi one пластинчатый nel ca rte r бетамотор.это
Для особых применений (морские платформы, наличники (планки) для сварных тяжелых профилей с полным проплавлением, сварные соединения с поперечным сварным швом или вообще, когда материал подвергается механическому напряжению в направлении толщины), это […] можно запросить в дополнение к тестам, запрошенным и / или требуемым […] стандарты, t h e пластинчатый t e ar испытания на сопротивление. rivagroup.com:80	Для особых случаев (морская форма, piattabande per travi saldate a piena Pentenrazione, giunti saldati a croce o più generalmente ove il materiale è sollecitato meccanicamente nel senso dello […] spessore) Возможно, вы найдете, в порядке доказательства, вы увидите, что номер . […] di resistenza a llo stra pp o пластинчатый . ривагруп.ком: 80
Все штекерные разъемы герметизируют штекер на […] конец кабеля wi th a пластинчатый s e al и убедитесь, что […] разгрузка кабеля согласно EN 61884. download.sew-eurodrive.com	Tutti i connettori sigillano la spina sull’estremità del cavo con una […] guarnizio ne a lamelle, g ar antendo così […] uno scarico del tiro соответствует EN 61884. download.sew-eurodrive.com
Поставка сепаратора типа EUROMEC DISOPAC, размер которого соответствует нормам DIN 1999, сборный моноблок из высокопрочного бетона, пригодный для очистки воды, поступающей с автостанций, автостоянок, закрытых автостоянок, в комплекте с внутренним оборудованием […] , состоящий из дефлектора из нержавеющей стали, […] фильтрующая секция wi t h пластинчатая p a ck из синтетического […] материал, не подверженный углеводородам […] Механизм , разгрузочное устройство с плавающим препятствием и перекрывающая плита с смотровым валом из горячеоцинкованного листа. euromec.net	Fornitura di separatore typeo EURO MEC serie DISOPAC, Реализована из азиенда, сертифицированного по ISO 9001, ISO 14001, OHSAS 18001 и второму количеству предварительно заданных значений Norme EN 858-1, классу 1 марки CE, диамного монструозного сборного образца ad alta resistenza idoneo per il trattamento di acque Provenienti da stazioni di servizio, piazzali di parcheggio, autorimesse coperte, Completo di Equipaggiamento interno composto da […] дефлеттор из нержавеющей стали acciaio, сравнение […] filtraz io ne co n p acc o lamellare i n m ate riale s intetico […] бесчувственный all’azione degli idrocarburi, […] dispositivo di scarico munito di otturatore a galleggiante e soletta di copertura con chiusino di ispezione in lamiera zincata a caldo ». euromec.net
После того, как maxi-quoins были готовы, можно было приступить к строительству огромных несущих арок с пролетами до 45 метров, расположенными в пространстве, предназначенными для поддержки […] — со стойками из нержавеющей стали — […] крыша состоит из из a пластин w o из конструкции и […] теплоизоляционный материал, защищенный […] на дополнительной высоте водонепроницаемым покрытием из предварительно окисленных медных листов. architetturadipietra.it	Dopo le fasi di formazione dei maxiconci in cantiere si process alla costruzione dei grandi archi portanti, con campate librate nello spazio fino a 45 metri, destinati a sorreggere — mediante l’ausilio di […] puntoni in acciaio inox — la copertura con […] распорка ur a in leg no lamellare e pac chett o termoisolante […] Protetto Sull’estradosso da Manto […] di tenuta in lastre di rame preossidato. architetturadipietra.it
После параллельных антидемпинговых и антисубсидионных разбирательств Совет наложил Постановление (ЕС) № 1628/2004 (2) ( […] оригинала Регламента), […] окончательные компенсационные меры 15,7% f o r Графит I n di a Limited, 7,0% для HEG Limited и 15,7% для всех другие компании по импорту cer ta i n графит e l ec trode системы, происходящие из Индии. eur-lex.europa.eu	Порядок параллельных антидемпинговых и антидемпинговых процедур, Il Consiglio, con il regolamento (CE) n. 1628/2004 (2) (di seguito «il regolamento iniziale»), ha istituito un […] дацио компенсативо […] Definitivo del 1 5,7 % pe r la Graphite In di a Li mite d, del 7,0% per la HEG Limited e del 15,7 % для всех других сообществ, импортируемых всеми системами и lett rodi d i grafite или ri gina ri d elndia elndia elndia elndia elndia elndia eur-lex.europa.eu

пластинчатый — английское определение, грамматика, произношение, синонимы и примеры

Теплообменники, не входящие в состав машин, а именно: пластинчатые теплообменники , , пластинчатые теплообменники, трубчатые теплообменники.

tmClass

Он снабжен тремя косыми складками, из которых задняя пластинчатая .

WikiMatrix

Окончательная антидемпинговая пошлина налагается на импорт некоторых изделий из чугуна с пластинчатым графитом (серый чугун) или чугуна с шаровидным графитом (также известного как высокопрочный чугун), а также их частей, подпадающих под действие кодов CN ex 7325 10 00 (Код TARIC 7325100031) и ex 7325 99 90 (код TARIC 7325999080) из Китайской Народной Республики.

Eurlex2019

Изобретение относится к продлению срока службы расширительного ролика (1), в частности ролика, который имеет пластинчатый разрез , эластомерное расширительное покрытие (17), которое расширяет плоское полотно (7) материала, проходящее по нему поперек направления хода, так что концевая втулка (9) соединяется соосно, по меньшей мере, с одним осевым концом области расширителя (5), а продольный край (7a) плоской ленты материала (7) поддерживается на указанной концевой втулке (9). .

патенты-wipo

Сланцы представляют собой слоистые породы, которые в основном состоят из пластинчатых минералов, таких как слюды.

WikiMatrix

Кроме того, слой (54) активного материала анода содержит активный материал анода, содержащий пластинчатый графит , который изогнут таким образом, что среднее количество изгибов (f) на частицу равно 0

патенты-wipo

Порошки пластинчатого состава ; хлопья

oj4

В водном растворе его фосфолипиды могут образовывать липосомы, двухслойные листы, мицеллы или ламеллярные структуры , в зависимости от гидратации и температуры.

WikiMatrix

Японцы начали производство приобретенных португальцами фитильных огней, и использование этого огнестрельного оружия в войне привело к постепенному сокращению использования многовековых ламеллярных доспехов , которыми славились самураи; Японские производители доспехов начали использовать твердые железные пластины в своих конструкциях доспехов, которые были основаны на европейских доспехах, и в конечном итоге пластинчатые доспехи стали стандартом для воинов-самураев.

WikiMatrix

Современные модели организации бактериохлорофилла и каротиноидов (основных компонентов) внутри хлоросом поместили их в пластинчатую организацию , где длинные фарнезольные хвосты бактериохлорофилла смешиваются с каротиноидами и друг с другом, образуя структуру, напоминающую многослойную липидную структуру.

WikiMatrix

Все аксо-дендритные синапсы глубоко встроены в тела клеток или складчатые пластинчатые отростки шванновских клеток, всегда окруженные инвагинированной складкой поверхностной мембраны шванновских клеток.

спрингер

16 августа 2017 года Европейская комиссия (далее — «Комиссия») ввела временную антидемпинговую пошлину на импорт в Европейский Союз («Союз») определенных изделий из чугуна с пластинчатым графитом (также известного как серый чугун) или Чугун с шаровидным графитом (также известный как высокопрочный чугун) и его части, происходящие из Китайской Народной Республики («КНР») в соответствии с Исполнительным регламентом Комиссии (ЕС) 2017/1480 (2) («временный регламент») .

eurlex-diff-2018-06-20

Плотная смесь с ферритом, другим продуктом аустенита, образует пластинчатую структуру , называемую перлитом.

WikiMatrix

Муфта упругая, имеющая пластинчатую конструкцию

патенты-wipo

Комплексный оксид лития-никеля, имеющий пластинчатую структуру , представляет собой соединение, представленное следующей общей формулой: LiNi1-x-yM1xM2yO2 (где M1 представляет собой Al и / или Mg; M2 представляет собой по меньшей мере один металлический элемент, выбранный из группы, состоящей из Co , Fe, Cu и Cr; 0.3 ≤ х ≤ 0,5; и 0 ≤ y ≤ 0,2).

патенты-wipo

Тот факт, что магний добавлен в процессе производства отливки из высокопрочного чугуна, изменяет структуру графита с чешуйчатой ​​/ пластинчатой ​​ на сфероидальную и придает ему различные механические свойства, такие как определенная деформируемость при напряжении сжатия.

ЕврЛекс-2

Осложнения с лоскутом (например, смещение лоскутов или складки лоскутов, которые требуют изменения положения, диффузный ламеллярный кератит и врастание эпителия) часто встречаются при хирургических операциях на роговице с пластинчатым , но редко приводят к необратимой потере остроты зрения.

WikiMatrix

Самоходный комбайн с регулируемым пластинчатым просеивателем

патенты-wipo

Затем можно вырезать пластинку (L), параллельную задней граничной поверхности (2.2).

патенты-wipo

Изобретение относится к упрочняющим кольцам, содержащим кольцо подшипника (3), которое изготовлено из изоляционного материала, стойкого к сжатию даже при высоких рабочих температурах, и металлическое зажимное кольцо (4), в которое вставлено кольцо подшипника, образуя двойной корпус; указанные усиливающие кольца используются в коллекторах электродвигателей с пластинчатыми внутренними перемычками (6), которые используются для фиксации отдельных пластин, которые выступают внутрь и проходят по меньшей мере преимущественно параллельно оси (2) коллектора и имеют поднутренные поверхности (8, 2). 7) для заднего зацепления усилительными кольцами.

патенты-wipo

Шлифовальный и полировальный инструмент для машин и аппаратов с механическими приводами, в частности, насадки, Шлифовальные круги, Чашечные круги, навесные лепестковые круги, пластинчатые лепестковые ролики , пластинчатые лепестковые валки , лепестковые ролики , лепестковые диски , шлифовальные ролики, полировальные швабры , Абразивные ленты и опоры для абразивных лент, ролики для абразивных лент, абразивные ролики и держатели абразивных роликов, диски из нетканого материала

tmClass

Изобретение относится к полой клапанной пластине (1) поршневого компрессора для жидкостного охлаждения пластинчатых клапанов , содержащей единую половину корпуса (3), имеющую охлаждающие каналы (4), открытые на стороне цилиндра и покрытые предпочтительно сварной или приклеенная пластина (2) по меньшей мере вдоль охлаждающих каналов (4), содержащая одну всасывающую лопатку (6), обработанную и соединенную как единую деталь в области каждого из всасывающих отверстий (5).

патенты-wipo

Дыхание происходит на поверхности ног через волокнистые перьевидные пластинки ( пластинчатых, эпиподитов). Самцы отличаются от самок тем, что вторые антенны заметно увеличены и превращены в сжимающие органы, используемые при спаривании.

WikiMatrix

Алюминиевые порошки непластинчатой ​​структуры

Eurlex2019

регулярно контролируемые средства защиты, такие как ламельные шторы , , быстродействующие двери.

Eurlex2018q4

.