Малое ядро у инфузории выполняет функцию: Какую функцию выполняет малое ядро инфузории?

m acronucleus (7) контролирует все функции выживания организмов.

Изучение микроорганизмов является частью многих направлений биологии, медицины и здравоохранения. Постоянные исследования небесных тел расширяют потребность в понимании влияния микрогравитации на микроорганизмы. Куда бы люди ни пошли, они несут с собой микроорганизмы. НАСА сейчас изучает микроорганизмы, взятые с Международной космической станции (МКС) . Как пребывание в космосе меняет микробы на МКС. Нет предела карьере, которая продолжит развиваться благодаря космической программе НАСА, такой как A стромикробиология, микробный инженер, генная инженерия и т. Д. …………………………

Для получения дополнительной информации о микробах и окружающей их среде см.

Макроядерная последовательность генома инфузорий Tetrahymena thermophila, модельный эукариот

Сборка генома и общая структура хромосомы

Секвенирование и сборка.

Используя методы физического выделения, МАК очищали из культуры T. thermophila штамма SB210 и использовали для создания множества библиотек секвенирования разного размера (таблица S1). Создание больших (более 10 т.п.н.) библиотек вставок не увенчалось успехом — обычная проблема при работе с геномами, богатыми AT. Приблизительно 1,2 миллиона парных концевых последовательностей были сгенерированы из библиотек и собраны с использованием Celera Assembler [37]. В начальной сборке митохондриальный геном (мтДНК; который присутствовал из-за некоторого загрязнения препарата MAC митохондриями) и сильно амплифицированная хромосома рДНК не собирались хорошо по сравнению с опубликованными последовательностями этих молекул [38,39].Вероятно, это было связано с тем, что контиги от этих молекул имели более высокую глубину покрытия, чем контиги от других хромосом, что заставило Celera Assembler рассматривать их как повторяющуюся ДНК. Таким образом, мы разделили чтение последовательностей на три блока (мтДНК, рДНК и основная ДНК MAC) и сгенерировали сборки для каждого блока отдельно. Это привело к умеренному улучшению, и, таким образом, три отдельные сборки использовались для всех последующих анализов. Подробная информация о последовательности и сборке представлена ​​в таблицах 1 и S2.

Основная сборка MAC содержит 1 971 каркас (контиги, которые были связаны в более крупные части с помощью информации о парных парах) с общим предполагаемым размером 104,1 Мб. Возможно, наиболее важно, используя комбинацию вычислительной и экспериментальной идентификации теломер, мы обнаружили, что многие концы каркаса соответствуют концам хромосом. Сто двадцать пять каркасов, составляющих 44% длины собранного генома, закрыты теломерами на обоих концах и, таким образом, вероятно, представляют собой полные MAC-хромосомы.Сто двадцать дополнительных каркасов, охватывающих еще 31% генома, закрыты теломерами на одном конце (Таблицы 1 и S3).

Точность и полнота сборки.

В целом, все анализы показывают высокую точность сборок MAC. Например, все 75 локусов MAC, которые находятся в разных генетических группах совокупного ассортимента (и, следовательно, должны находиться на разных хромосомах [40]), отображаются на разных каркасах, и все пары локусов, которые коассортируются (и, следовательно, должны находиться на одной хромосоме) либо отображаются на один и тот же скаффолд, либо на два не полностью закрытых скаффолда, чей совокупный размер меньше, чем у соответствующей MAC хромосомы (Table S4).Для 24 полностью собранных хромосомных каркасов, для которых мы знаем соответствующий физический размер хромосомы, существует очень сильная корреляция между физическим размером и длиной сборки. Кроме того, нет случаев, когда каркас значительно длиннее физического размера соответствующей хромосомы (рис. 3А). Наконец, все 96 последовательностей MIC, которые, как известно, соседствуют с сайтами Cbs [24,41,42], которые соответствуют каркасу MAC, сделали это только на конце каркаса.

Рисунок 3.Размеры скаффолда

(A) Размеры скаффолда по сравнению с размером хромосомы MAC. Голубые ромбы представляют собой каркасы, покрытые теломерами с обоих концов. Красные квадраты и зеленые треугольники представляют собой незавершенные каркасы, покрытые теломерами с одного или обоих концов, соответственно.

(B) Распределение размеров каркасов, покрытых теломерами с обоих концов.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.0040286.g003

Общая точность сборок указывает на то, что многие из потенциальных трудностей, обсуждаемых во Введении, не были значительными.Например, мы видим мало доказательств полиморфизма среди прочтений, что, вероятно, является отражением использования инбредной линии и процесса фенотипического ассортимента, который приводит к полногеномным гомозиготным линиям MAC [43]. Кроме того, поиск известных последовательностей, специфичных для MIC, показывает, что степень загрязнения MIC очень низка (например, соединения Cbs имеют 0,044-кратное покрытие, что примерно в 200 раз меньше, чем объемные хромосомы MAC) и ограничиваются небольшими контигами (большинство меньше чем 5 кб). Равномерная глубина покрытия контигов и точность сборок также предполагают, что хромосомы присутствуют в примерно одинаковом количестве копий и что только ограниченные количества повторяющейся ДНК присутствуют в MAC, оба из которых дополнительно обсуждаются ниже.

Общая длина каркаса намного меньше предсказанного размера генома от 180 до 200 мегабайт [14]. Учитывая точность сборок, большое количество хромосом, частично или полностью закрытых, и тот факт, что все (более 200) известные последовательности ДНК MAC обнаружены в сборках, мы заключаем, что сборки представляют собой очень большие (более 95 %) фракция генома. Таким образом, мы пришли к выводу, что предыдущие оценки размера генома были неточными (что неудивительно, учитывая, что они были сделаны почти 30 лет назад) и что размер генома близок к 105 мегабайтам.Однако возможно, что некоторые хромосомы или области были недостаточно представлены в наших библиотеках из-за смещения очистки или клонирования, и, таким образом, нельзя сделать вывод об отсутствии какого-либо конкретного гена или функции просто из-за их отсутствия в наших текущих сборках.

Оценка количества хромосом MAC.

Общее количество хромосом MAC неизвестно. Теломерное покрытие каркасов позволяет нам установить минимальную границу для этого числа на уровне 185 (125 плюс половина 120). Один из способов оценки действительного числа — это анализ прочтений, не содержащих теломеры рДНК; 3328 таких считываний могут быть связаны в общей сложности с 370 концами каркаса.Это соответствует приблизительно 9-кратному охвату (3,328 / 370), что существенно не отличается от общего покрытия MAC-хромосом, равного 9,08, указывая на то, что нет значительной недопредставленности прочтений теломер (Таблицы 1 и S3). Таким образом, поскольку всего имеется 4058 таких считываний (остальные не могут быть связаны), мы оцениваем, что существует приблизительно 451 конец теломер (4058/9), и, таким образом, имеется примерно 225 хромосом (451/2). Независимая оценка фактического числа хромосом может быть сделана, если предположить, что распределение размеров полностью закрытых хромосом (см. Рисунок 3B) является репрезентативным для генома в целом.Поскольку эти 125 закрытых хромосом составляют 43,5% от общей длины сборки, это может предсказать всего 287 хромосом (125 / 0,435). Это, вероятно, будет завышенной оценкой, поскольку более крупные хромосомы статистически менее вероятно, что они будут в полностью собранном наборе. Действительно, средний размер полностью собранных хромосом составляет 359 т.п.н., тогда как оценки среднего размера MAC-хромосом, полученные с помощью гель-электрофореза в импульсном поле, значительно выше [29,41]. Таким образом, мы заключаем, что существует от 185 до 287 хромосом, скорее всего, где-то около 225.

Отсутствие многих стандартных глобальных признаков эукариотических хромосом.

Отметим, что мы искали, но не смогли найти многие из того, что считается стандартными глобальными характеристиками эукариотических хромосом. Напр., Мы не смогли найти последовательности или структурные особенности, общие для нескольких хромосом, которые могли бы рассматриваться как кандидаты на центромерные регионы. Это согласуется с экспериментальными исследованиями [44]. Кроме того, хотя у многих эукариот определенные гены и повторяющиеся элементы группируются около теломер [45–51], мы не можем обнаружить здесь какой-либо такой кластеризации.Это не потому, что эти функции не отличаются друг от друга; например, содержание GC (Рисунок S1) и плотность генов (Рисунок S2) сильно различаются. Вместо этого, отсутствие сходной глобальной структуры между MAC-хромосомами, вероятно, связано с отсутствием процессов, которые помогают генерировать ключевые особенности нормальных эукариотических хромосом (например, митоз и мейоз, которые у T. thermophila ограничены MIC).

Количество копий хромосомы MAC одинаково.

Высокое качество и полнота сборок предполагают, что вариация числа копий по крайней мере среди большинства MAC-хромосом относительно невелика, поскольку в противном случае ассемблер рассматривал бы контиги из чрезмерно представленных хромосом как повторяющуюся ДНК.Такое равномерное количество копий согласуется с генетическими экспериментальными данными для шести хромосом [31], но его универсальность для всех хромосом неизвестна. Мы поняли, что относительное количество копий хромосом можно оценить по глубине охвата наших сборок (при условии, что клонирование и секвенирование были относительно случайными). Когда все каркасы исследованы, глубина покрытия становится удивительно однородной (рис. 4). Уменьшение однородности и покрытия, наблюдаемое по мере уменьшения размера каркаса, вероятно, является отражением как случайного низкого покрытия некоторых регионов, так и того, что некоторые из небольших каркасов являются контаминантами МПК.Когда в анализ включены только каркасы, покрытые теломерами на обоих концах, наблюдаемое покрытие последовательностей становится еще более однородным (красные ромбы на рисунке 4). Хотя мы не можем исключить, что некоторые меньшие, не полностью собранные хромосомы поддерживаются с разным числом копий, наблюдаемая однородность указывает на то, что репликация и / или сегрегация большей части или всех основных хромосом MAC находится под скоординированным регулированием.

Общие характеристики предсказанных генов, кодирующих белки, и некодирующих РНК

Прогнозы генов, кодирующих белок.

Мы идентифицировали 27 424 предполагаемых гена, кодирующих белок в геноме (таблица 2), большое количество для одноклеточных видов. Эти генные модели были протестированы путем сопоставления тегов экспрессируемых последовательностей (EST) со сборками генома с использованием PASA [52]. Мы отмечаем, что большинство этих EST были созданы после того, как модели были построены (Таблица S5). Из 9122 идентифицированных кластеров EST большинство либо не конфликтует с генными моделями (49,5%), либо относительно небольшие (17,7% имеют пропущенный экзон и 9,8% предполагают, что модели необходимо объединить или разделить).Только 408 (4,4%) кластеров являются межгенными по сравнению с генными моделями. Хотя они могут представлять собой пропущенные гены или участки генов, они также могут быть некодирующими РНК (нкРНК) или загрязнением геномной ДНК библиотек кДНК. Кроме того, предсказанные интроны и интроны, полученные из EST, весьма схожи по распределению размеров, за исключением коротких и длинных крайних значений (Рисунок S3), содержания GC (16,3% против 16,7%) и сайтов сплайсинга [только небольшое количество (85) из У интронов на основе EST есть исключения из соединений 5′-GT… AG-3 ‘, предполагаемых моделью — это могут быть просто ошибки секвенирования].Эти анализы показывают, что генные модели относительно надежны и их должно быть более чем достаточно для того, чтобы делать общие прогнозы относительно кодирующего потенциала этого вида.

Две другие линии доказательств предполагают, что предсказанное число генов не завышено. Во-первых, большое количество предсказанных генов совпадают с известными или предсказанными генами других видов (14 916 имеют совпадение BLASTP с E-значением лучше, чем 10 ^-10 ), а во-вторых, экспериментальные исследования сложности мРНК предсказывают транскрипцию не менее 25 000 генов со средним размером 1 200 п.н. [53].Отметим также, что последовательность самой большой MAC-хромосомы другой инфузории, Paramecium tetraurelia, , указывает на высокую плотность кодирования, а экстраполяция на полный геном предсказывает, по крайней мере, 30 000 генов, кодирующих белок [54].

нкРНК и использование всех 64 кодонов для кодирования аминокислот.

нкРНК, обнаруженные в геноме, перечислены в таблице S6. Обращаем внимание на несколько новых открытий. Из 174 предполагаемых генов 5S рРНК (таблица S6A) 19 не соответствуют ни одному из четырех ранее описанных генов T.thermophila [55,56]. Эти 19 отличаются друг от друга простыми заменами нуклеотидов в 34 положениях, а также различными вставками, делециями и усечениями и могут представлять собой псевдогены. Кроме того, присутствуют две формы мяРНК U2 (Таблица S6C), которые мы назвали U2 (четыре гена) и U2var (пять генов). Семейства функциональных генов РНК экспрессируются повсеместно в течение жизненного цикла T. thermophila, а также в стрессовых условиях (репрезентативные данные показаны на рисунке S4).Самый большой класс — это тРНК с 700 идентифицированными (таблицы S6B и S6D), число, согласующееся с оценками, основанными на гибридизации [57].

Одной из наиболее необычных особенностей T. thermophila и некоторых других инфузорий является использование альтернативного генетического кода, в котором канонические стоп-кодоны UAG и UAA кодируют глутамин [58]. Важность и возраст этого альтернативного кода отражены в геноме наличием 39 тРНК для этих кодонов. Примечательно, что анализ генома также выявил присутствие тРНК, которая, как предполагается, декодирует оставшийся стоп-кодон, UGA.Многочисленные доказательства указывают на то, что это действующая тРНК селеноцистеина (Sec), так называемой 21-й аминокислоты. У тех эукариотических видов, которые используют Sec, большинство кодонов UGA все еще вызывают терминацию трансляции, в то время как те мРНК, которые кодируют Sec-содержащие пептиды, имеют характерный мотив последовательности стебель-петля в 3′-области UTR, который управляет включением Sec [59,60]. Предполагаемая тРНК-Sec T. thermophila была идентифицирована путем анализа последовательности генома и показала, что она транскрибируется и ацилируется [61], и мы обнаружили, что она экспрессируется и заряжается и что ее заряд может находиться под отдельным регуляторным контролем со стороны других тРНК. (Рисунок S4A).Кроме того, мы идентифицировали шесть генов T. thermophila с кодонами UGA в рамке считывания, которые выравниваются (после редактирования генных моделей) с известными кодонами Sec их гомологов из других видов эукариот и которые имеют консенсус «стебель-петля» и, таким образом, вероятно, будут кодируют селенопротеины. Таким образом, мы заключаем, что UGA почти наверняка транслируется в Sec, что сделало бы T. thermophila первым известным организмом, использующим все 64 триплетных кодона для определения включения аминокислот.

Эволюция генома

Ошибка использования кодонов и аминокислот.

Хотя T. thermophila может использовать все 64 кодона, но не все они одинаково. Наиболее важным аспектом использования кодонов у этого вида является то, что богатые AT кодоны, как правило, используются чаще, чем другие [62,63]. Таким образом, хотя смещение AT в геноме наиболее сильно в некодирующих областях, где считается, что отбор ослаблен, он наблюдается даже в кодирующих областях. Фактически, притяжение AT настолько велико в кодирующих областях, что аминокислотный состав белков смещен в сторону кодонов с высоким содержанием AT, как это видно у других видов с экстремальным смещением AT (например.г., [64]). Хотя общее использование кодонов смещено по сравнению с кодонами, богатыми GC, на уровне каждого гена существует значительная вариация в степени смещения. Мы определили два доминантных паттерна этой вариации от одного гена к другому. Основная закономерность состоит в том, что для большинства генов используемые кодоны являются просто отражением общего содержания AT в гене (рис. 5). Различия между генами обусловлены вариациями содержания AT в пределах генома (см. Рисунок 5A), хотя мы не смогли выявить механизм, лежащий в основе этой вариации (например,g., нет кластеризации генов с высоким или низким AT возле теломер). Однако существует менее распространенный образец вариации от одного к другому, что очень важно. Существует подмножество генов (показано красным), которые используют общий предпочтительный набор кодонов, который отличается от такового для среднего гена, и кодоны в этом наборе не сильно коррелируют с содержанием AT генов. Хотя о существовании такого предпочтительного набора кодонов для этого вида сообщалось [62,63], анализ генома позволяет более точно определить набор и гены, которые его используют.Всего, используя относительно консервативное отсечение (рис. 5В), мы идентифицировали 232 таких гена.

Рисунок 5. Использование кодонов

(A) Эффективное количество кодонов (ENc; мера общего смещения кодонов) для каждой предсказанной ORF отображается в зависимости от GC3 (доля кодонов, которые являются синонимичными в позиции третьего кодона, которые имеют либо гуанин или цитозин в этом положении). Верхний предел ожидаемого смещения, основанного только на GC3, представлен черной кривой; большинство ОРС T. thermophila группируются под кривой [красные точки, как на (B)].

(B) Анализ главных компонентов относительного использования синонимичных кодонов у T. thermophila. 232 гена в хвосте распределения в форме запятой (те, которые используют наиболее предвзятые кодоны) окрашены в красный цвет.

(C) Анализ главных компонентов относительного использования синонимичных кодонов в P. falciparum.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.0040286.g005

Считается, что использование геном предпочтительных кодонов обеспечивает более эффективную или точную трансляцию [65].Это, по-видимому, имеет место здесь, поскольку из предсказанных генов с использованием предпочтительного подмножества многие, вероятно, имеют функции домашнего хозяйства, и, хотя они составляют только 0,85% всех предсказанных генов, 12,5% всех EST сопоставляются с ними (Таблица S7). . Хотя некоторые из них не имеют совпадений EST и теоретически могут представлять ошибочно предсказанные гены, кажется маловероятным, что ложные гены будут использовать предпочтительный набор кодонов. Таким образом, мы прогнозируем, что эти гены-выбросы либо сильно экспрессируются (по крайней мере, в некоторых из условий, с которыми обычно сталкивается организм), либо выполняют некоторую критическую функцию, требующую точной трансляции.

Считается, что различия в использовании кодонов между генами оказывают лишь небольшое влияние на приспособленность. Чтобы естественный отбор эффективно воздействовал на различия в использовании кодонов и, таким образом, создавал предпочтительное подмножество, факторы, усиливающие генетический дрейф (например, небольшие размеры популяции, инбридинг), должны быть слабее, чем силы отбора [66]. Таким образом, хотя использование кодонов, вероятно, находится под давлением отбора у всех видов, не все могут развить предпочтительные наборы кодонов. Например, хотя у него такое же смещение AT с T.thermophila, , в апикомлексе Plasmodium falciparum не было обнаружено предпочтительного набора (рис. 5C), что, возможно, отражает его паразитический образ жизни и ограниченный эффективный размер популяции. Присутствие предпочтительной подгруппы у T. thermophila, вероятно, является отражением большого эффективного размера популяции из-за его свободно живущего, воспроизводящего половым путем образа жизни (см. [66,67] для дополнительного обсуждения большого размера популяции этого вида).

Гены, происходящие из пластид, не могут быть идентифицированы.

Один из вопросов, представляющих особый интерес, на который геном T. thermophila может пролить свет, касается времени происхождения пластид, обнаруженных у apicomplexans и dinoflagellates, других членов альвеолят [68,69]. Хотя пластиды в этих линиях различаются (например, пластиды apicomplexans, известные как апикопласты, даже не участвуют в фотосинтезе), оба, как полагают, имеют происхождение из красных водорослей [70]. Это привело к предположению, что пластиды в этих линиях являются результатом единственного эндосимбиотического события между предком apicomplexans и динофлагеллят и красной водорослью, при этом ядро ​​водорослей потеряно, а пластида водорослей сохраняется.Ключевой вопрос заключается в том, произошел ли этот вторичный эндосимбиоз до или после отделения инфузорий от двух других ветвей. Возможность того, что это произошло до расщепления инфузорий, известна как хромальвеолатная гипотеза [71].

Для того, чтобы гипотеза хромальвеолатов была верной, потеря пластид должна была произойти у инфузорий, скорее всего, в основании дерева инфузорий, поскольку современные инфузории, как известно, не содержат пластиды. Если бы у предка инфузорий когда-то была пластида, возможно, что некоторые гены, полученные из пластид, были бы перенесены в ядерный геном (как это произошло во многих линиях, включая апикомплексы и динофлагелляты [72]), и, кроме того, некоторые такие гены будут все еще можно найти у Т.термофила. Чтобы проверить эту возможность, мы построили филогенетические деревья всех генов в геноме и провели поиск генов с паттерном ветвления, соответствующим пластидному происхождению (см. Материалы и методы). Для T. thermophila, w e не видит никакого сигнала для генов пластидного происхождения, который превышает шум, наблюдаемый в таких автоматизированных филогенетических анализах.

Несколько линий свидетельств предполагают, что это не общий недостаток филогенетического подхода, использованного здесь. Например, мы использовали тот же подход для идентификации и каталогизации пластидных генов в других линиях, включая растение Arabidopsis thaliana и apicomplexan P.falciparum. Кроме того, такой подход был использован для обнаружения прошлых эндосимбиозов у ​​других эукариотических клонов [73]. Наконец, используя тот же подход, мы идентифицировали 91 вероятно происходящий из митохондрий ген (Таблица S8) в ядерном геноме T. thermophila. Это важно, потому что гены, происходящие из митохондрий, обычно труднее идентифицировать, чем гены, происходящие из пластид [74], отчасти потому, что пластидный симбиоз появился позже [75].

Тем не менее, поскольку возможно, что наш филогеномный скрининг мог пропустить некоторые гены, происходящие из пластид, мы также провели целенаправленный поиск генов, которые, как можно было ожидать, будут сохранены, используя апикопласт в качестве модели.Апикопласты участвуют в биосинтезе жирных кислот, изопреноидов и гема. Пути биосинтеза жирных кислот и изопреноидов представляют особый интерес, потому что пути, происходящие из пластид, отличаются от аналогичных путей в цитоплазме эукариот [76]. В случае биосинтеза изопреноидов гены белков в каноническом эукариотическом цитозольном мевалонатном пути присутствуют, как и ожидалось на основании экспериментальных исследований [77–79], но не было обнаружено никаких ферментов, участвующих в пути DOXP, происходящем из пластид.Что касается биосинтеза жирных кислот, хотя T. thermophila не требует экзогенного поступления жирных кислот для роста, не удалось найти никаких доказательств полной версии пути типа I (обычно цитозольного). Хотя присутствуют по крайней мере некоторые гены пути типа II, их недостаточно для синтеза жирных кислот de novo и, по-видимому, более вероятно, что они происходят из митохондрии, чем из пластиды.

На основании общего и целевого поиска мы пришли к выводу, что в настоящее время нет доказательств наличия пластидных или предковых пластидных генов у T.термофила. Это не исключает возможности того, что другие инфузории имеют ферменты, происходящие из пластид или даже пластиды, но в настоящее время нет доказательств, подтверждающих это, несмотря на обширные ультраструктурные наблюдения [80,81]. Если у инфузорий отсутствуют все доказательства пластиды, это может означать либо то, что предполагаемое раннее происхождение хромальвеолатной пластиды неверно, либо то, что предок T. thermophila (и, возможно, все инфузории) полностью потерял пластиду и все определяемые гены, происходящие из пластид. .Последняя возможность имеет прецедент, так как некоторые апикомплексы, такие как Cryptosporidia, потеряли свои апикопласты и имеют немного, если таковые имеются, производных от пластид генов в своих ядерных геномах [82,83]. Было высказано предположение, что эта потеря является результатом рационализации метаболизма в ответ на паразитарный образ жизни. Решение вопроса о том, присутствовала ли пластида у предка инфузорий, будет важно для нашего понимания эволюции пластид и их биохимических взаимоотношений с эукариотическими хозяевами.

IES нацелено на чужеродную ДНК, а не на повторяющуюся ДНК

Как обсуждалось во Введении, существует множество параллелей между процессом вырезания IES и другими явлениями подавления повторяющихся элементов, такими как RIP и образование гетерохроматина. Несмотря на эти параллели, процессы значительно различаются по своим механизмам действия и, следовательно, вероятно, имеют разные краткосрочные и долгосрочные эволюционные последствия. Например, у видов с RIP вся повторяющаяся ДНК становится мишенью для мутационной инактивации, что привело к резкому подавлению эволюционной диверсификации за счет дупликации генов [84,85].Процесс вырезания IES приводит к исключению определенных последовательностей ДНК MIC из транскрипционно активного MAC. Экспериментальное введение чужеродных трансгенов в МИК показало, что с увеличением числа копий МИК повышается эффективность удаления трансгена [86]. Следовательно, можно предсказать такое же подавление дупликации генов, что и при RIP. Однако, вместо того, чтобы нацеливаться на повторяющуюся ДНК как таковую, было предложено, чтобы эксцизия IES специфически нацелена на чужеродную ДНК, которая вторглась в MIC зародышевой линии, но не представлена ​​в MAC [35,87,88].Дублирование гена MIC и функциональная диверсификация все еще возможны в этом сценарии, если при каждом событии конъюгации копии гена не расходятся в последовательности, достаточной для того, чтобы их можно было распознать как чужеродные и исключить из MAC; так как секс является частым явлением в естественных популяциях T. thermophila [89], это должно быть так. Поэтому мы стремились использовать данные последовательности генома как для проверки гипотезы о чужеродной ДНК, так и для изучения последствий процесса эксцизии IES для эволюции T.геном thermophila.

Анализ генома позволяет выявить несколько линий доказательств, которые убедительно подтверждают гипотезу о чужеродной ДНК. Во-первых, в МАК присутствует небольшое, но, тем не менее, значительное количество повторяющейся ДНК. Это лучше всего видно при анализе каркасов, которые соответствуют полным хромосомам MAC, которые вряд ли содержат контаминацию MIC IES. Эти каркасы содержат диспергированные повторы, составляющие 2,3% всей ДНК. Это означает, что некоторая повторяющаяся ДНК обходит процесс вырезания IES.Вторая линия доказательств прибывает из исследования небольших контигов и синглтонов (несобранных последовательностей) в данных сборки. Известные специфические для MIC элементы, такие как транспозоны REP и Tlr 1 [90,91], обнаруживаются только в этих небольших контигах, которые, таким образом, явно обогащены специфичной для MIC ДНК (а также для повторяющейся ДНК; см. Рисунок S5). Фактически, небольшие контиги содержат гомологи необычайно широкого диапазона кладов мобильных элементов (TE) для одноклеточного эукариота [92,93], включая многие ранее не описанные в Tetrahymena (Таблица S9).Мы не находим подходящих совпадений с TE ни в одном из крупных контигов. Таким образом, транспозоны в целом, по-видимому, очень эффективно отфильтровываются процессом вырезания IES. Тандемные и диспергированные повторы в MAC, по-видимому, соответствуют неинвазивной ДНК (например, генам 5S рРНК). Взятый вместе, тот факт, что мобильные (и, вероятно, инвазивные) элементы ДНК не попадают в MAC, в сочетании с тем фактом, что как тандемные, так и диспергированные неинвазивные повторы избегают процесса вырезания, указывает на сильную поддержку гипотезы чужеродной ДНК.

У организмов с RIP, поскольку вся дуплицированная ДНК является мишенью [94], диверсификация генов путем дупликации подавляется. Например, доля всех генов Neurospora crassa, обнаруженных в паралогичных семьях, составляет всего 19%, значение, которое находится ниже общей линии корреляции между этой долей и общим числом генов [84]. Кроме того, очень немногие пары генов имеют более 80% идентичности аминокислотной последовательности [84]. В соответствии с гипотезой чужеродной ДНК, мы не видим таких признаков подавления диверсификации семейства генов у T.термофила. В геноме обнаружено большое количество паралоговых генов (1970 семейств генов, включая 10 851 предсказанный белок) (Таблица 3). Доля генов таких семейств у T. thermophila (39%) намного выше, чем у N. crassa. Хотя эта доля не так высока, как можно было бы предсказать из наблюдаемой корреляции между общим числом генов и фракцией, обнаруженной в паралогичных семьях [84], доля пар генов, имеющих более 80% аминокислотной идентичности, намного выше, чем в N .crassa и аналогично тому, что обнаружено у других секвенированных эукариот.

Поскольку возможно, что некоторые из 1970 семейств генов могли возникнуть в результате дупликаций, произошедших до начала процесса вырезания IES, более полезно изучить недавние дупликации . Мы искали такие дупликации множеством способов, включая идентификацию генов, дублированных в линии T. thermophila относительно других линий, для которых доступны геномы (Таблица S10), и путем поиска пар паралогов с очень похожими последовательностями.Оба этих класса широко распространены у T. thermophila, , что дополнительно указывает на то, что иссечение IES не оказывает значительного влияния на расширение семейств генов «нативных» генов. Таким образом, инфузорийная система нацеливания на вторгающуюся ДНК имеет значительно другие последствия, чем RIP.

Большое количество генов у

Расширение семейств генов помогает объяснить высокое количество генов у T. thermophila, , которое выше, чем у других протистов, и даже превосходит количество некоторых многоклеточных (Таблица 4).События дублирования, по-видимому, распределены по эволюционному времени, причем некоторые из них были древними, а некоторые — совсем недавними. Мы искали, но не нашли доказательств ни полногеномной, ни сегментарной дупликации. Мы действительно находим огромное количество тандемно дублированных генов. Всего было обнаружено 1603 тандемных кластера от двух до 15 генов, включая 4276 генов; 67% этих кластеров представляют собой простые пары генов, а 96% содержат пять или меньше генов. Таким образом, многие гены-паралоги T.thermophila — это результат отдельных небольших событий дублирования.

Большое количество генов у T. thermophila по сравнению с некоторыми другими одноклеточными эукариотами не просто отражение расширения семейства генов. Например, когда недавние экспансии генов объединяются в наборы ортологов, мы обнаруживаем, что у людей и T. thermophila больше ортологов друг с другом (2280), чем у людей и дрожжей S. cerevisiae (2097) или T. thermophila и P. .falciparum (1,325) (рис. 6), несмотря на родственные связи между животными и грибами, с одной стороны, и инфузориями и апикомплексами, с другой.Мы отмечаем, что это не означает, что люди и T. thermophila в целом более похожи друг на друга, чем на виды в сестринских типах. Например, люди и S. cerevisiae действительно разделяют некоторые процессы, которые развились у общего предка грибов и животных. Кроме того, для ортологов, обнаруженных у всех эукариот, гены человека и S. cerevisiae более похожи по последовательности друг на друга, чем на гены T. thermophila. Большее количество ортологов, общих между людьми и T. thermophila, является отражением как потери генов в других эукариотических линиях, так и сохранения T.термофила. В соответствии с этим выводом, существует 874 человеческих гена с ортологами у T. thermophila, но не у S. cerevisiae, 58 из которых соответствуют локусам, связанным с заболеваниями человека (Таблица S12). Таким образом, анализ генома показывает множество случаев, когда T. thermophila может продолжать дополнять экспериментальные исследования дрожжей как модельной системы для клеточной биологии эукариот (и человека) [13].

Рисунок 6. Ортологи, общие для T. thermophila и отдельных эукариотических геномов

Диаграмма Венна, показывающая ортологи, общие для человека, дрожжей S.cerevisiae, апикомплексан P. falciparum, и T. thermophila. Дупликации генов, специфичных для клонов, в каждом из организмов были идентифицированы и рассматривались как один единственный ген (или суперортолог). Затем попарные взаимные наилучшие совпадения по BLASTP были идентифицированы как предполагаемые ортологи.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.0040286.g006

Дупликация гена как индикатор важных биологических процессов

Одним из мотивов получения последовательности генома организма является продвижение изучения уже исследуемых процессов.Многие исследователи, в том числе те, кто никогда раньше не работал с этим видом, воспользовались общедоступными данными, чтобы достичь этой цели (например, [24,95–103]). Вместо того, чтобы сосредоточить наш биоинформатический анализ на этих хорошо изученных процессах, мы решили искать доказательства в предсказанном протеоме процессов, имеющих особое значение для организма. Наш подход был относительно простым — мы искали избыточное количество (по сравнению с другими эукариотами) в списках семейств паралогичных генов или расширений семейств генов, специфичных по клонам, связанных с различными процессами.Такой подход был выбран по нескольким причинам. Во-первых, поиск различий в больших семействах генов не так подвержен ошибкам аннотации, как поиск, сфокусированный на отдельных генах. Кроме того, большие семейства генов явно вносят вклад в большое количество генов, присутствующих в T. thermophila по сравнению с другими одноклеточными эукариотами. Мы отмечаем, что многие из доступных геномов одноклеточных эукариот принадлежат паразитам, которые были выбраны для секвенирования в основном из-за их медицинской значимости, и что они не являются репрезентативными (например,г., многие имеют довольно маленькие геномы). Наиболее важно то, что наличие больших семейств генов и недавние дупликации генов, вероятно, указывают на функциональное разнообразие, недавние эволюционные инновации и давление отбора, оказываемое на этот организм.

Наш анализ семейств паралогичных генов и, в частности, недавно дублированных членов таких семейств показывает важность процессов, связанных с восприятием изменений окружающей среды и реагированием на них. Мы выделяем здесь пять таких процессов: трансдукция сигнала, мембранный транспорт, протеолитическое расщепление, конструирование и изменение формы и движения клеток и мембранный перенос.Все эти процессы имеют решающее значение для свободноживущего гетеротрофного образа жизни этого организма. В следующих разделах мы обсудим, что анализ генома показывает об этих процессах у T. thermophila, уделяя особое внимание расширению генов, связанных с этими функциями, по сравнению с другими видами.

Сигнальная трансдукция и расширения семейств киназ.

Множество генов, предположительно играющих роль в передаче сигналов, были идентифицированы в наших скринингах паралоговых генов.Из них мы решили провести углубленный анализ киназ, потому что они представляют собой такое разнообразное семейство белков и потому, что было обнаружено, что они играют важную роль в сенсорных и регуляторных процессах на всем древе жизни. Всего в геноме было идентифицировано 1069 предсказанных протеинкиназ (таблицы 5 и S11A). Это соответствует примерно 3,8% предсказанного протеома, фракции значительно больше, чем примерно 2,3% у грибов, Drosophila, и позвоночных [104].Среди них были обнаружены представители 54 известных семейств и подсемейств киназ [105]. Некоторые семейства, обнаруженные у большого разнообразия эукариот [106], не были обнаружены. Сюда входят киназа контрольной точки CHK1 / RAD53, связанная с киназой PI3 киназа TRRAP, две циклин-зависимые киназы (CDK7 и CDK8, которые могут быть функционально заменены родственным расширенным семейством CDC2) и два плохо консервативных класса (Bub1 и Haspin). которые могли быть пропущены поисками гомологии последовательностей. Несмотря на сообщения о наличии фосфотирозина в T.thermophila [107], явных членов группы тирозинкиназ идентифицировать не удалось. Однако геном кодирует некоторые белки, которые могут быть альтернативными тирозинкиназами, включая множественные киназы двойной специфичности (например, Wee1, Ste7, TTK и Dyrk), а также пять членов родственной группы TKL, которые могут опосредовать фосфорилирование тирозина в слизи. плесень Dictyostelium discoideum [106]. Двенадцать классов киназ обнаружены у T. thermophila и человека, но не у дрожжей, и, таким образом, являются очевидными примерами сохранения предковых функций эукариот, обсуждаемых выше.Некоторые из генов этих классов вовлечены в этиологию заболеваний человека (Dyrk1A, DNAPK, SGK1, RSK2, Wnk1 и Wnk4) [108].

Ключевой особенностью кинома T. thermophila является расширение нескольких классов киназ по сравнению с другими секвенированными организмами (Таблица 5). Последствия некоторых из этих расширений можно предсказать, основываясь на известных функциях членов семьи. Напр., Семейства митотических киназ Aurora, CDC2 и PLK все существенно расширились, возможно, отражая дополнительную сложность передачи сигналов, требуемую двумя ядрами, которые одновременно участвуют в очень разных процессах в одной и той же цитоплазме клетки.Также расширены множественные киназы, которые взаимодействуют с сетью микротрубочек [109,110] [напр., Nima-related kinases (NRKs) и семейство ULK], возможно, отражая диверсификацию цитоскелетных систем (обсуждается более подробно ниже). Из семейств киназ с известными функциями наиболее поразительным является присутствие 83 гистидиновых протеинкиназ (HPK), которые обычно участвуют в передаче сигналов из внешней среды [111]. HPK обнаруживаются преимущественно в двухкомпонентных регуляторных системах бактерий, архей, простейших и растений и отсутствуют у многоклеточных животных.Большинство HPK T. thermophila имеют домены-приемники субстрата, и многие из них, как предполагается, являются трансмембранными рецепторами.

Полное значение киномного разнообразия T. thermophila трудно предсказать, поскольку большая часть диверсификации произошла в классах, функции которых плохо изучены. Например, во многих известных семейств киназ белки T. thermophila сильно различаются по последовательности как по отношению к таковым у других видов, так и друг к другу (например.g., см. рисунок S6). Возможности диверсификации T. thermophila, возможно, лучше всего видны в том факте, что 630 (приблизительно 60%) киназ не могут быть отнесены к какому-либо известному семейству или подсемейству [105]. Всего в этом геноме идентифицировано 37 новых классов киназ и сотни уникальных белков. Присутствие стольких новых киназ и расширений во многих известных классах киназ одновременно является показателем универсальности эукариотического домена протеинкиназы, наблюдаемой в других клонах [112], и наводит на мысль о большой разработке функций, специфичных для ресничек.

Диверсификация мембранных транспортных систем.

Многие из наиболее широко распространенных семейств генов T. thermophila кодируют белки, которые, как предполагается, участвуют в мембранном транспорте. Мембранные транспортеры играют решающую роль в реагировании на изменения в окружающей среде и использовании доступных ресурсов. Поэтому мы провели более тщательный анализ предполагаемых переносчиков у этого вида. В целом T. thermophila обладает надежной и разнообразной коллекцией предсказанных систем мембранного транспорта (Таблицы 6 и S11B).Сравнение с другими эукариотами [113] обнаруживает некоторые интересные различия с точки зрения обоих классов переносчиков и предполагаемых перемещаемых субстратов. Например, T. thermophila имеет больше представителей в каждом из четырех основных семейств, чем человек. Кроме того, он кодирует гораздо большее количество переносчиков в суперсемействе ABC, потенциал-управляемых ионных каналов (VIC) и АТФаз P-типа, чем любой другой секвенированный вид эукариот (Таблица 6), включая других свободноживущих протистов, диатомовых водорослей. Thalassiosira pseudonana, и слизевик D.дискоидеум. Что касается субстратов, был идентифицирован чрезвычайно обширный набор переносчиков, вероятно, специфичных для неорганических катионов (таблица 6). Большинство из них являются транспортерами канального типа и АТФазами P-типа, транспортирующими катионы. Интересно, что, несмотря на очевидную массовую амплификацию переносчиков катионов, T. thermophila имеет очень ограниченный набор переносчиков неорганических анионов: были идентифицированы только по одному члену для сульфатного, фосфатного, арсенита и хромат-иона, а прогнозируемые анионные каналы отсутствуют.Причина разницы в амплификации переносчиков катионов и анионов неясна.

Как и в случае с киназами, некоторые из наиболее интересных свойств выявляются при изучении специфичных для клонов дупликаций переносчиков. Недавние кластеры включают белки канала K ⁺ (285 членов), транспортеры ABC (152 члена), транспортирующие катионы АТФазы (59 членов), белки бета субъединицы канала K ⁺ (22 члена), оксалат: формиатные антипортеры (24 члена). члены), транспортеры сахара (22 члена) и АТФазы, транспортирующие фосфолипиды (20 членов).Экспансия белков канала K ⁺ , которые являются переносчиками VIC-типа, была особенно значительной и продолжалась.

Всего было предсказано 308 селективных каналов VIC-типа K ⁺ , что намного больше, чем у любых других секвенированных видов, и более чем в три раза больше, чем у людей (89). Мультигенное семейство калиевых ионных каналов также было идентифицировано у P. tetraurelia [114] и, таким образом, может быть общей характеристикой некоторых инфузорий. Некоторые данные свидетельствуют о том, что это расширение у инфузорий может быть адаптивным.Во-первых, каналы K ⁺ контролируют пассивное проникновение K ⁺ через мембрану, что важно для подвижности ресничек [115]. Во-вторых, новая аденилилциклаза с предполагаемым N-концевым ионным каналом K ⁺ регулирует образование универсального вторичного мессенджера цАМФ в инфузориях и апикомплексах [116,117], который может помочь в ответе на внезапные изменения ионного окружения. T. thermophila кодирует шесть гомологов этой аденилатциклазы / транспортера K ⁺ , тогда как паразитические apicomplexans P.falciparum и Cryptosporidium parvum кодируют только по одному.

Присутствующие надежные транспортные системы, вероятно, являются отражением поведенческой и физиологической универсальности T. thermophila как свободноживущего одноклеточного организма и его воздействия на широкий спектр различных субстратов в естественной среде. Изучение конкретных типов расширений позволяет предположить, что функции, связанные с переносом K ⁺ и других катионов, значительно разнообразились.Таким образом, такие функции могут играть роль во многих уникальных аспектах биологии этого вида и инфузорий в целом.

Протеолитический процессинг.

T. thermophila — прожорливый хищник, поэтому можно ожидать, что он обладает широким разнообразием протеолитических ферментов. Анализ предсказанных белков в T. thermophila показывает некоторые противоречивые результаты, относящиеся к этой идее. С одной стороны, многие из крупнейших кластеров дупликаций, специфичных для клонов, относятся к протеазам (например,, папаин, лейшманолизин). С другой стороны, общее количество идентифицированных протеаз (480) относительно невелико с точки зрения доли протеома (1,7%) по сравнению с другими модельными организмами, которые были секвенированы и аннотированы [118–120]. Конфликт, скорее всего, является отражением разнообразия физиологических процессов, в которых функционируют протеазы [121]. Таким образом, мы рассмотрели подклассификацию типов протеаз, присутствующих более подробно.

Используя номенклатуру протеаз Merops, основанную на внутренних эволюционных и структурных отношениях [119], T.Протеазы thermophila были разделены на пять каталитических классов и 40 семейств. Это: 43 аспарагиновые протеазы, принадлежащие двум семействам, 211 цистеиновые протеазы, принадлежащие 11 семействам, 139 металлопротеаз, принадлежащие 14 семействам, 73 сериновые протеазы, принадлежащие 12 семействам, и 14 треониновых протеаз, принадлежащих семейству T1 (таблицы 7 и S11C). Некоторые уникальные особенности T. thermophila можно увидеть при сравнении с P. falciparum, который является наиболее близкородственным секвенированным видом, для которого опубликован подробный анализ его протеаз [122].В обоих геномах присутствует 21 семейство протеаз. Например, высококонсервативные треониновые протеазы и семейства убиквитинкарбоксил-концевых гидролаз (C12 и C19) отражают решающую роль АТФ-зависимой системы убиквитин-протеасома, которая участвует в контроле клеточного цикла и стрессовой реакции [123] . У T. thermophila присутствует девятнадцать семейств протеаз, но не P. falciparum. Один из них включает лейшманолизин (M8), первоначально идентифицированный у кинетопластидного паразита Leishmania major и предположительно участвующий в процессинге поверхностных белков [124–126].Это семейство значительно расширено (до 48 членов, включая 15 в тандемном массиве) у T. thermophila и предполагает, что здесь могут быть важны поверхностные белковые процессы, хотя функции лейшманолизин-связанных протеаз у некинетопластидных эукариот остаются неясными. Семейства карбоксипептидазы A (M14) и карбоксипептидазы Y (S10) расширены до 28 и 25 членов, соответственно, у T. thermophila, , что может отражать многочисленные и разнообразные функции. Только четыре семейства протеаз присутствуют у P.falciparum не обнаружены у T. thermophila. Среди них — метакаспаза (C14), наследственный тип каспазы, который характерен для апоптоза или апоптозоподобных путей передачи сигнала [127].

Самыми большими кластерами расширенных протеаз у T. thermophila являются все цистеиновые протеазы, которые составляют 44% от общего протеазного комплемента. Два наиболее известных семейства из этого класса — это семейство папаина (C1), которое является наиболее многочисленным и сложным семейством, состоящим из 114 членов, и семейство убиквитинкарбоксил-концевой гидролазы 2 (UCh3, C19), состоящее из 47 членов.Возможно, что биохимическая активность паралогов внутри этих семейств сохраняется, но они используются в разных частях клетки (или вне клетки) или на разных стадиях развития T. thermophila.

Компоненты и регуляторы цитоскелета.

Инфузории имеют очень сложную архитектуру цитоскелета [128] с сильно поляризованными типами клеток, которые собирают 18 типов микротрубочковых органелл в определенных местах вдоль переднезадней и дорсовентральной оси.Поэтому мы стремились определить, отражено ли это разнообразие в геноме. Как и в случае с анализом протеазы, описанным выше, первоначальное сравнение количества конкретных типов цитоскелетных и связанных с микротрубочками белков было несколько неоднозначным (числа для людей и T. thermophila показаны в таблицах 8 и S11D). Напр., Хотя двигатели кинезина и динеина, а также киназы, ассоциированные с микротрубочками, по-видимому, расширяются, структурные компоненты ресничек и участники пути внутрижладжкового транспорта не расширяются.Кроме того, некоторые типы белков цитоскелета, по-видимому, отсутствуют у T. thermophila; , они включают белки промежуточных филаментов (включая ядерные ламины), как уже предполагалось в биохимических исследованиях [129], некоторые белки, связанные с микротрубочками (MAP2, MAP4 и Tau, для которых не были обнаружены неживотные гомологи эукариот) и некоторые актин-связывающие белки. (например, α-актинин). Чтобы лучше понять, какую роль гены, участвующие в функциях микротрубочек и цитоскелета, могли играть в диверсификации этого вида, мы сосредоточили анализ на некоторых генах с очевидным расширением: тубулинах, динеинах и регуляторных белках.

Тубулины.

Тубулины являются ключевыми структурными компонентами микротрубочек, и у эукариот они встречаются во многих формах [130]. В геноме T. thermophila филогенетический анализ гомологов тубулина (рис. 7) выявляет присутствие одного или двух генов, каждый из основных подсемейств альфа (α), бета (β) и гамма (γ) (как сообщалось ранее [ 131–133]) и по одному в каждой из дельта (δ), эпсилон (ε) и эта (η), которые обнаруживаются у организмов, которые обладают центриолями / базальными тельцами [134–136].Кроме того, T. thermophila кодирует неканонические гомологи тубулина, которые можно разделить на две категории. К первой категории относятся гены, наиболее похожие на канонические α- или β-тубулины. Эти девять генов (три α-подобных и шесть β-подобных) лишены характерных мотивов для посттрансляционных модификаций хвостового домена (полиглутамилирование и полиглицилирование), которые существенны для функции их канонических аналогов [137–139]. Три β-подобных гена ( BLT1, / TTHERM_01104960, TTHERM_01104970 и TTHERM_01104980) образуют тандемный кластер с межгенными интервалами менее 2 т.п.н.Мы предполагаем, что эти гены функционируют, возможно, избыточно, в формировании или функционировании некоторых из многих высокоспециализированных систем микротрубочек клеток T. thermophila. Экспериментальный анализ BLT1 , β-подобного тубулина, показал, что его продукт локализуется в небольшом субнаборе микротрубочек и не включается в растущие аксонемы ресничек (К. Кларк и М. Горовский, неопубликованные данные). Генетическая делеция этого гена или α-подобного гена TTHERM_00647130 не дала явного фенотипа (R.Се и М.А. Горовский, неопубликованные данные).

Рисунок 7. Разнообразие гена тубулина у T. thermophila

На рисунке показано дерево соединения соседей, построенное на основе выравнивания clustalX. Сокращения видов: Hs, H. sapiens; Dm, D. melaogaster; Sc, S. cerevisiae; Tt, T. thermophila; Pt, P. tetraurelia; Cr, C. reinhardtii; Tb, T. brucei; Ec, E. coli; Xl, Xenopus laevis. Прокариотический ортолог тубулина, Escherichia coli FtsZ, был использован в качестве внешней группы.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.0040286.g007

Вторая категория неканонических гомологов тубулина состоит из трех новых белков (TTHERM_00550910, TTHERM_01001250 и TTHERM_01001260), которые попадают в кладу с тубулином P. tetraurelia iota. . Два из них (TTHERM_01001250 и TTHERM_01001260) тесно связаны друг с другом (рис. 7) и тесно связаны в геноме и, таким образом, вероятно, возникли в результате недавней тандемной дупликации.Функции этих генов неизвестны, но поскольку они пока уникальны для инфузорий, они могут отвечать за функции микротрубочек, специфичные для этого типа.

Динеины.

Динеины, которые были впервые обнаружены в Tetrahymena [140], представляют собой молекулярные моторы, которые перемещаются по трекам микротрубочек, процесс, критический для многих активностей T. thermophila, включая биение ресничек, кариокинез, деление MAC, корковую организацию и фагоцитоз. Многие из этих действий имеют решающее значение для восприятия изменений в окружающей среде и реагирования на них.Каждый динеиновый комплекс состоит из одной, двух или трех тяжелых цепей (содержащих двигательную активность) и конкретных комбинаций более мелких субъединиц, включая промежуточные, легкие промежуточные и легкие цепи, которые регулируют двигательную активность и связывание динеина с его молекулярным грузом. [141–143]. У организмов с ресничками или жгутиками существует множество изоформ динеинов, включая динеины аксонемного внешнего плеча, аксонемные динеины внутреннего плеча и неаксонемные или «цитоплазматические» динеины. Каждый из них специализируется на своем внутриклеточном расположении и выполняемых клеточных задачах [144].

Всего мы идентифицировали 21 легкую цепь, пять промежуточных цепей, две легкие промежуточные цепи и 25 тяжелых цепей (Таблица S13). Экспрессию каждого гена, а также структур экзон / интрон большинства подтверждали с помощью ОТ-ПЦР и, при необходимости, секвенирования продукта ОТ-ПЦР. По большей части, семейства субъединиц динеина T. thermophila похожи на семейства других модельных организмов; однако есть некоторые интересные отличия. Легкие цепи LC3A и 3B T. thermophila наиболее сходны с LC3 и LC5 зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii [145].Эти белки принадлежат к большему семейству белков, связанных с тиоредоксином, и без биохимических данных, идентифицирующих один или оба белка как часть динеинового комплекса, может быть преждевременно маркировать их как компоненты динеина. Легкая цепь LC4 принадлежит к семейству белков, связанных с кальмодулином, и может регулировать кальций-зависимое обращение ресничек. T. thermophila экспрессирует два гена LC4, возможно, обеспечивая альтернативные или дополнительные способы контроля подвижности ресничек по сравнению с видами, которые экспрессируют только один.В других системах LC8 ассоциирован с несколькими разными динеиновыми и нединеиновыми комплексами, а T. thermophila экспрессирует один канонический LC8, а также пять дивергентных LC8-подобных генов с неизвестными функциями.

Возможно, наиболее интересным открытием является то, что T. thermophila экспрессирует 25 тяжелых цепей динеина. К ним относятся 14 ранее описанных генов DYH [146,147] и 11 новых, все из которых, по-видимому, являются аксонемными. Сложность семейства DYH может представлять механизм, с помощью которого организм может точно настраивать активность ресничек, производить специализированные реснички (например,g., оральные и задние реснички) и / или быстро генерируют большое количество новых ресничек. Наряду с этим произошла экспансия и других моторных белков. Например, имеется 78 кинезинов, больше, чем в любом другом секвенированном организме ([101] и Таблица 8). Кроме того, хотя миозинов меньше, чем у людей (13 против 22), 12 из 13 генов T. thermophila составляют единственный новый класс миозинов, не обнаруженный у других организмов [102,148].

Регуляция микротрубочек и процессов, связанных с микротрубочками.

Среди расширенных генов T. thermophila есть множество, участвующих в регуляции микротрубочек или связанных с микротрубочками процессов. Одним из примеров является тубулин-тирозин-лигаза-подобные доменные белки, несколько членов которых были идентифицированы как ферменты, ответственные за полиглутамилирование α- или β-тубулина [149]. T. thermophila кодирует 50 белков, подобных тирозинлигазе тубулина, по сравнению с 14 белками у человека. Другим примером является семейство протеинкиназ NRK, которое, как упоминалось выше, претерпело большое распространение в T.термофила. NRKs часто обнаруживаются связанными с микротрубочковыми органеллами [150], такими как центриоли, базальные тельца и жгутики, и играют множество ролей, включая регуляцию созревания центросом [151] и иссечение жгутиков [152]. Мы идентифицировали 39 NRK в T. thermophila, что примерно в три раза превышает количество таких локусов у человека. Филогенетический и функциональный анализ подтвердил, что эта диверсификация адаптировала членов этого семейства к различным субклеточным локализациям и цитоскелетным ролям [103].Таким образом, такие генные экспансии могут позволить изоформам белка с различной направленностью регулировать функцию одного и того же типа органелл в разных местах или создавать разные свойства одних и тех же структурных строительных материалов (например, микротрубочек), которые используются в качестве каркасов для построения различных типов органелл. .

Секреторные пути и мембранный трафик.

Помимо обычных органелл, T. thermophila поддерживает несколько более специализированных мембраносвязанных компартментов, включая альвеолы ​​(общие с другими альвеолами), сократительную вакуоль (обнаруженную у многих протистов) и отдельные, функционально отличные макронуклеары и микроядра [128].Он также имеет несколько путей интернализации плазматической мембраны, а также конститутивного и регулируемого экзоцитоза [128, 153]. Сортировка и транспортировка компонентов мембраны являются критическими функциями для всех этих действий. Анализ генома выявляет гомологи многих ключевых белков, которые, как известно из других эукариот, участвуют в образовании и слиянии везикул, включая все основные классы белков оболочки (Таблица S14). Одно интересное открытие, сделанное анализом генома, заключается в том, что T. thermophila кодирует восемь белков, связанных с динамином, больше, чем большинство других секвенированных одноклеточных эукариот, и два из них, Drp1p и Drp2p, развили новую функцию в эндоцитозе [96] (A.Рахаман и А. П. Туркевиц, неопубликованные данные). Более того, филогенетический анализ показал, что привлечение динамина к роли в эндоцитозе происходит независимо путем конвергентной эволюции в клонах животных и инфузорий [96].

Диверсификация мембранного транспорта более очевидна в отношении Rab белков, которые представляют собой небольшие мономерные GTPases, которые регулируют процессы слияния и деления мембран. T. thermophila, с 69 Rab (Таблица S15), имеет большее количество линий, чем у людей (у которых их 60), чем у многих одноклеточных видов, таких как Saccharomyces cerevisiae, у которого 11 [154] и Trypanosoma brucei , , в котором 16 [155].На основании локализации и функциональных исследований, включая сравнение дрожжей и людей [156], Rab были разделены на восемь групп [157]. Филогенетический анализ (Рисунок S7) показывает, что T. thermophila кодирует представителей всех групп, кроме IV и VII, которые участвуют в позднем эндоцитозе и транспорте Гольджи, соответственно. Для группы VII это, по-видимому, отражает потерю, специфичную для клонов, поскольку геномы T. brucei и Entamoeba histolytica имеют несколько гомологов в этой группе.Два Rabs T. thermophila оказались гомологичными Rab28 и Rab32, которые не были отнесены ни к одной из этих групп; Ранее считалось, что Rab32 ограничен клонами млекопитающих. Группы II и V Rab, участвующие в эндоцитозе, особенно велики у T. thermophila и включают несколько гомологов Rab2, Rab4 и Rab11 в группе II. Это может отражать сложность поддержания по крайней мере двух основных путей интернализации мембраны. Кроме того, 29 Rab у T. thermophila не могут объединяться ни с одной из групп Rab, более широко встречающихся среди эукариот.В этой группе 20 кластеров в три клады, обозначенные Tetrahymena клады I, II и III на рисунке S7, которые могут представлять собой излучения, специфичные для инфузорий. Остальные девять очень расходятся и могут представлять очень древние события дублирования и / или изменения, связанные с наймом для новой функции. Поскольку однозначное выравнивание среди таких расходящихся Rabs затруднено, их отношения станут более ясными по мере секвенирования дополнительных родственных геномов.

Недавно большое количество Rab было обнаружено у множества амебоидных протистов, включая D.discoideum, E. histolytica [158] и парабазалид Trichomonas vaginalis [159]. Было высказано предположение, что диверсификация этих видов связана с их амебоидным образом жизни [159]. Однако наличие значительной диверсификации у T. thermophila предполагает, что различный образ жизни простейших может сопровождаться их собственным брендом значительной диверсификации Rab.

Выводы и планы на будущее

При секвенировании и сборке генома MAC T. thermophila ожидалось много серьезных проблем, которые обычно не наблюдаются в проектах генома эукариот.В целом, однако, сборки удивительно точны и представляют собой превосходный охват генома. Это, вероятно, во многом связано с низким уровнем повторяющейся ДНК, одной из особенностей генома MAC, которая изначально побудила нас выбрать его для секвенирования. Данные о последовательности в наших текущих собраниях, безусловно, достаточно полны для детального анализа предсказанной биологии этого вида, как мы сообщали здесь и другие показали. Кроме того, последовательность генома уже используется во многих функциональных геномных исследованиях с использованием имеющихся мощных экспериментальных инструментов.В этом отношении будет очень полезно провести сравнительный анализ с последовательностями генома других инфузорий, таких как P. tetraurelia и Oxytricha trifallax, , которые находятся в стадии разработки.

Одна из наших основных целей — получить полную последовательность генома MAC, и еще предстоит решить некоторые проблемы. Поскольку нам не удалось получить качественные данные о последовательностях из больших клонов-вставок, любая область генома MAC, содержащая значительные количества повторяющейся ДНК, не могла бы собраться должным образом.Чтобы преодолеть эту ловушку, мы теперь используем HAPPY mapping [162] в качестве альтернативного подхода к получению такой связывающей информации. Также известно, что по крайней мере концы по крайней мере двух MAC-хромосом, присутствующих сразу после конъюгации, исчезают во время последующего вегетативного роста, что может указывать на то, что эти хромосомы неспособны к долгосрочному поддержанию [41]. Как и ожидалось, мы не находим в нашей базе данных последовательности, соответствующие этим концам. Таким образом, потребуются альтернативные методы для получения последовательностей этих областей и любых других, потерянных во время раннего вегетативного роста.Несмотря на эти проблемы, все данные свидетельствуют о том, что можно будет закрыть весь геном MAC.

Конечно, один только геном MAC не дает нам полной картины генома T. thermophila. Секвенирование генома MIC будет сложнее из-за большего количества повторяющейся ДНК. Однако мы сможем использовать геном MAC в качестве основы, и, таким образом, в некотором смысле секвенирование MIC будет эквивалентно закрытию генома, а не независимому проекту.Мы уже начали в этой области с определения последовательности, смежной с соединениями MIC Cbs, и сопоставления их со сборками MAC, а также наоборот — с использованием последовательностей, смежных с теломерами MAC, для извлечения областей, фланкирующих MIC Cbs [24,41].

Наличие последовательности MIC и сопоставление MIC с MAC будет полезно для понимания многих аспектов биологии T. thermophila, которые мы не можем изучать с помощью MAC. К ним относятся функция центромеры, особенности теломер MIC и степень, в которой MAC и MIC у T.thermophila и другие инфузории являются эквивалентом соматических и половых клеток. Возможно, наиболее важным является то, что наличие обоих геномов позволит провести подробный анализ процесса перестройки ДНК в масштабе всего генома. Только имея обе последовательности генома, мы можем полностью понять биологию этого удивительного вида.

Структура генома зародышевой линии Tetrahymena thermophila и связь с массивно реаранжированным соматическим геномом

[…] В рукописи есть некоторые оставшиеся проблемы, которые необходимо решить, прежде чем она будет признана принятой, как указано ниже.В частности, все три рецензента и рецензент считают, что работа будет иметь наибольшее влияние, если она будет более читаемой для широкой аудитории eLife. Текст мог бы дать читателям немного больше рекомендаций относительно общих выводов их выводов, как подробно описано ниже. Кроме того, рукописи было бы полезно иметь сводную цифру, иллюстрирующую основные результаты: повторяющиеся богатые центромерные области, консервативные позиции CBS и не поддерживаемые хромосомы.

1) Большая часть информации из подразделов «Секвенирование и сборка генома MIC» и «Построение и анализ суперсборок MIC по длине хромосомы» может быть изложена в краткой форме в тексте, а представленные детали могут быть поместите в Методы или в дополнительный материал. Это поможет читать статью более гладко.

Как было предложено рецензентом, подробный материал в этом разделе был перемещен в раздел «Материалы и методы» и на новый рисунок 1 — приложение к рисунку 1.Мы также переместили детали секвенирования и сборки генома в «Материалы и методы», а сводку статистики сборки (бывшая таблица 1) — в дополнительный файл 1A.

2) Зашифрованная ДНК, предназначенная для Mac, описанная в подразделе «ДНК, предназначенная для зашифрованных макронуклеарных хромосом», представляет интерес, и авторы описывают механизмы как отличные от того, что есть в гипотрихах. Было бы полезно иметь цифру, чтобы следовать тому, что обнаружили авторы. Они заявляют, что это будет рассмотрено в другой рукописи, но если они собираются сообщить об этом хотя бы в некоторой степени здесь, цифра и немного больше деталей о том, что отличается, очень помогут.

Мы поняли, что сравнение с дескремблированием генов у Spirotrichs может быть преждевременным. Мы удалили отдельный заголовок этого раздела и переместили упрощенный абзац, без ссылки на дескремблирование, под обсуждение поломки хромосомы. Как следствие, мы считаем, что больше нет необходимости добавлять еще одну цифру.

3) Первые шесть абзацев подраздела «MIC Centromeres» можно сокращать и сокращать. Весь раздел особенно длинный и умозрительный, а местами повторяющийся.Понятие мейотического драйва вставлено в середину описания структуры и сравнения с другими организмами. Можно ли отредактировать раздел, чтобы подтянуть прозу, а может, и сократить?

Значительно сокращен раздел центромер MIC. Некоторая подробная информация была перенесена на новый рисунок 2 — дополнение к рисунку 1 и в дополнительный файл 1E.

4) Обсуждение запрограммированного удаления последовательностей Cen в шестом абзаце подраздела «Центромеры MIC» должно иметь цифру, позволяющую читателю проследить за структурами, о которых идет речь.

Обсуждение запрограммированного удаления последовательностей Cen было сокращено и упрощено; в результате мы не считаем, что для этого требуется дополнительная цифра.

5) В седьмом абзаце подраздела «МИК Центромеры» обсуждаются не поддерживаемые хромосомы, которые обсуждаются позже. Это не относится к разделу «MIC Centromeres», где оно находится в настоящее время.

Обсуждение необслуживаемых хромосом перенесено в более поздний, более подходящий раздел рукописи.

6) В девятом абзаце подраздела «Центромеры MIC» обсуждение транскриптов из микрофонных последовательностей на самом деле представляет собой краткое изложение литературы и гипотезу и должно проводиться в отдельном обсуждении, а не в середине раздела, посвященного центромерам. .

В ответ на этот пункт и пункт 14 эта спекулятивная гипотеза была опровергнута.

7) Обсуждение Cbs в подразделах «Семейство последовательностей хромосомных разрывов (Cbs)», «Набор из 225 Cbs в геноме MIC» и «Вырождение мотива Cbs среди функциональных Cbs» должно быть значительно сжатым.Консенсусная последовательность уже была известна, поэтому авторам следует тратить на это меньше времени и просто начинать новую информацию, которую предлагают дополнительные последовательности.

В соответствии с рекомендациями, этот раздел был значительно сокращен.

8) Аналогичным образом обсуждение сохранения CBS у разных видов в подразделах «Сохранение участков разрыва хромосом у видов Tetrahymena» и «Дублирование областей Cbs на эволюционной шкале времени» должно быть значительно сокращено и объединено с идентификацией Сайты CSB обсуждались выше.

По предложению рецензента мы значительно сократили разделы, переместив детали в Материалы и методы и дополнительные файлы. Однако мы считаем, что объединение идентификации и характеристики всех 225 Cbs в T. thermophila с обсуждением сохранения Cbs у разных видов было бы неуместным. Одним из основных результатов предыдущего анализа является полная картина диапазона изменчивости последовательности Cbs; небольшая выборка Cbs, идентифицированных у других видов, попадает в этот диапазон, как мы указываем в этом разделе.Однако наиболее интересным выводом из последнего анализа является сохранение местоположений Cbs, что приводит к сохранению размера и содержания генов MAC-хромосом. Этот вывод полностью независим от анализа сохранения последовательности Cbs и был бы невозможен без межвидового сравнения в этом разделе.

9) Подраздел «Не поддерживаемые хромосомы MAC» можно объединить с обсуждением фенотипических наборов в десятом абзаце подраздела «Центромеры MIC», и этот раздел следует сократить.

В целях сокращения рукописи обсуждение фенотипического ассортимента, на которое ссылается рецензент, было перенесено в легенду Дополнительного файла 1E. В любом случае мы считаем, что обсуждение необслуживаемых хромосом стоит само по себе. Как и предполагалось, он был сокращен.

10) Резюме и заключение не потребовались бы, если бы авторы заявили результаты, а затем написали краткое обсуждение.

Чтобы избежать повторения результатов (и удлинения рукописи), которое было бы необходимо, если бы был включен отдельный раздел для обсуждения, мы включили краткие обсуждения, которые вытекают непосредственно из результатов по всей рукописи.Мы значительно сократили и переориентировали исходный раздел «Резюме и выводы», который теперь называется «Выводы и будущие направления».

11) На рисунке 2 кажется, что было бы полезно, если бы авторы обозначили область, которая, по их мнению, содержит центромеру каждой хромосомы.

Запрошенное изменение внесено в рисунок.

12) В четвертом абзаце подраздела «Дублирование областей Cbs на эволюционной шкале времени» требуется точка после «взаимосвязи».

Исправление сделано.

13) В четвертом абзаце подраздела «Дублирование областей Cbs на эволюционной шкале времени». Идея о том, что CBS вводится инвазией транспозонов, приводящей к использованию этой последовательности в качестве сайта фрагментации хромосомы, является убедительной, но способ ее описания не является обязательным. Это не было бы «связано» с инвазией транспозонов, это было бы результатом инвазии и последующего одомашнивания фермента разрушения.Это один из примеров, связанных с моим общим замечанием о том, что рукопись может быть написана более кратко и ясно.

«Связанный с» был изменен на «возникший из», как это было предложено.

14) Описание возможной роли RNAi и Dicer-like 1 в функции центромеры должно быть уменьшено. В дополнение к Mochizuki, K et al. (2004) в статье процитирована роль Dcl1 в митозе и мейозе, во втором исследовании Malone, CD et al. (2005) исследовали фенотипы потери функции Dcl1 и не обнаружили доказательств какой-либо роли Dcl1 в сегрегации хромосом.Различия между результатами двух исследований никогда не согласовывались, поэтому использование только одного исследования в качестве вспомогательной информации для Обсуждения может ввести в заблуждение менее информированного читателя.

Это исправление было сделано. См. Пункт 6 выше.

15) Эта рукопись включает данные из двух других рукописей. А именно, аннотация мобильного элемента (TE) (Kapusta et al.) И отображение делеций (Cassidy-Hanley et al.), Данные, используемые для хромосомного ландшафта (рисунок 2) и для определения центромерных областей 5 хромосом зародышевой линии (на рисунке 2 и таблица 2).Документ TE, кажется, «отправлен», тогда как отображение удаления находится «в стадии подготовки». Я предлагаю включить в эту рукопись схему удаления. Поскольку эта рукопись несколько многословна и спекулятивна, будет нетрудно сжать текст (сократить рукопись), чтобы освободить место для данных удаления, которые на самом деле уже присутствуют, за исключением, возможно, дополнительной таблицы и / или рисунка, и параграф в Материалы и методы. Это не должно препятствовать более подробной второй статье по этому вопросу.Что касается аннотации к транспонируемым элементам, я надеюсь, что ее можно будет опубликовать вместе с этой рукописью. Было бы даже лучше (но, вероятно, невозможно) представить хотя бы основные результаты в настоящей рукописи, чтобы получить исчерпывающий обзор хромосом зародышевой линии Tetrahymena, включая не только CBS, но и аннотации TE.

В этом пункте сделаны два предложения. Публикация нашего анализа последовательностей Tetrahymena IES рядом с текущей рукописью, как было предложено рецензентом, была нашей первоначальной целью.Редакция eLife решила не полностью рецензировать рукопись IES в том виде, в каком она была первоначально представлена, но предложила вариант переноса «ключевых результатов» в первую рукопись. Первоначально мы решили продвинуться вперед с полным представлением первой рукописи, но после прочтения обзоров и консультаций с рецензирующим редактором Кэтлин Коллинз мы решили воспользоваться первоначальным советом и перенести ключевые результаты анализа IES во всеобъемлющий (но существенно сжатый и тщательно реорганизованная) рукопись о структуре и реорганизации генома.Второе предложение заключалось в том, чтобы включить в эту рукопись данные о картировании хромосомных делеций. Исследование делеционного картирования было многолетним усилием под руководством доктора Донны Кэссиди-Хэнли и с участием многих студентов-исследователей. Лишь небольшая часть идентифицированных делеций была информативной относительно местоположения центромер. Мы обеспокоены тем, что полная публикация методов и частичных результатов этих усилий может поставить под угрозу способность доктора Кэссиди-Хэнли и его коллег опубликовать полную историю в высококачественном журнале и получить то внимание и освещение, которых заслуживает эта история.Мы не считаем, что отсутствие этих подробных результатов умаляет нашу рукопись. Однако мы включили новый рисунок 2 — добавление к рисунку 1, показывающий, как набор делеций использовался для разграничения центромеры области хромосомы 5. Остальные центромеры были разграничены аналогичным образом. Мы считаем, что эта цифра проясняет, как был проведен анализ делеции, без ущерба для будущей публикации всего исследования.

16) Подраздел «ДНК, предназначенная для зашифрованных макронуклеарных хромосом» является слабым.Слово «скремблированный» вводит в заблуждение, поскольку предлагаемый механизм (HR между повторами) отличается от того, что Oxytricha использует материнскую направляющую РНК для дескремблирования MDS. Сравнение с соединением V (D) J вводит в заблуждение, поскольку этот процесс включает путь негомологичного соединения концов (NHEJ), а не HR. Наконец, это основано на ДНК MAC от одного карионида с последующим выделением одного полностью отобранного вегетативного клона, не так ли? Как можно подтвердить такой редкий процесс, не глядя на ДНК по независимо преобразованным и сортированным линиям?

См. Наш ответ на пункт №2.

17) Как идентифицируются IES? Они просто оперативно определены как области в сборке MIC, которые удаляются в сборке MAC? Есть ли другие критерии? В пятом абзаце подраздела «Центромеры MIC» упоминается, что «мы охарактеризовали тысячи IES, специфичных для MIC». Что такое характеристика, просто идентификация на основе выравнивания последовательностей? Или это ссылка на данные отдельной рукописи TE? В «Материалы и методы» ничего не нашел.

Теперь эта информация включена. Смотрите наш ответ на пункт 15.

18) Чтобы избежать путаницы, я думаю, следует уточнить, что IES в Paramecium — это многочисленные короткие, уникальные копии некодирующих последовательностей (во многих случаях остатки транспозонов), в то время как IES в Tetrahymena являются (или включают) переносимые элементы и другие повторяющиеся последовательности (как четко указано в подразделе «Центромеры MIC»). Это следует прояснить во втором абзаце Введения (и почему 40 000 вместо опубликованных 45 000 IES Paramecium?).

Предлагаемые исправления внесены.

19) Поскольку теломерные повторы MIC и MAC различаются, и известно точное количество хромосом MIC и MAC, может ли численность теломерных повторов (и количество Cbs?) В считывании позволить оценить контаминацию MAC (подраздел «Центромеры MIC») , последний абзац)? Если теломерные повторы MIC и ранее охарактеризованные субтеломерные области могут быть идентифицированы в парах считывания (как в библиотеках коротких вставок, так и в библиотеках прыжков), могут ли они быть сопоставлены с каркасами MIC (подраздел «Построение и анализ суперсборок MIC с длиной хромосомы» ”, Последний абзац)? При наличии всего 10 концов хромосом MIC (но 169-кратного охвата) это может быть сложно.

Мы ценим предложение рецензента оценить степень загрязнения MAC путем сравнения повторов теломер MAC и MIC и попытаться идентифицировать и связать теломеры MIC с другими каркасами. Мы искали теломерные повторы MIC в сборках и чтениях, но, к сожалению, нашли мало примеров, и они малоинформативны. Мы добавили текст в соответствующий раздел (Материалы и методы в ответ на пункт №1), разъясняющий этот вопрос. В любом случае, мы не думаем, что оценка загрязнения ПДК может значительно улучшить или изменить наши выводы.Мы четко признаем, что существует некоторое загрязнение, которое неизбежно с учетом экспериментальных ограничений, но, как указано в первом абзаце материалов и методов: «Путем микроскопического подсчета очищенных ядер (с учетом относительной ядерной плоидности) мы оцениваем загрязнение макронуклеарная геномная ДНК составляла менее 2% ». Мы уверены, что это загрязнение не оказало существенного влияния на сборку генома MIC каким-либо образом, что могло бы повлиять на выводы этой статьи. Следовательно, текст, идентифицированный рецензентом, был изменен, чтобы объяснить плохую сборку теломерных областей как результат их повторяющейся природы, как это наблюдается в сборках генома многих других организмов.

20) В первом предложении подраздела «Секвенирование и сборка генома MIC», «очень богатый AT»: можете ли вы указать значения для сборок MAC и MIC (77,7% и 76,3%) или среднее (~ 77%) в скобках?

Эти значения (сборка MAC 77,7% и сборка MIC 77,9%) были добавлены в соответствующий раздел материалов и методов.

21) В последнем предложении подраздела «Секвенирование и сборка генома MIC» допущена опечатка («как будет описано»).Что еще более важно, это предложение не совсем оправдано, так как только небольшая часть последовательностей, ограниченных зародышевой линией Paramecium, была аннотирована и опубликована на сегодняшний день. Я не понимаю, как можно провести глобальное сравнение, к тому же оно сделано в отдельном документе TE. То, что эта организация отличается, было известно давно из молекулярных исследований перестройки генома.

Данный текст удален.

22) В абзаце шестом подразделе «MIC Centromeres».Предположение о том, что хромосомы Paramecium MAC являются плечами хромосом MIC, было сильно спекулятивным, когда оно было опубликовано в 2008 году, и основывалось на косвенных доказательствах, а именно на обратной корреляции между содержанием G + C и длиной хромосомы MAC. Было высказано предположение, что эта обратная корреляция может быть объяснена смещенной конверсией генов, что указывает на то, что хромосомы MAC могут быть пропорциональны по размеру плечам хромосом MIC (поскольку хромосомы MIC подвергаются мейотической рекомбинации). Совсем недавно была опубликована работа по центромерам Paramecium, так что было бы разумно удалить спекулятивное утверждение и сослаться только на работу по центромерам.Более того, я думаю, что еще слишком рано говорить о фундаментальных различиях в архитектуре хромосом зародышевой линии, по крайней мере, в том, что касается центромер, поскольку может оказаться, что центромеры теряются в ходе обычного процесса элиминации IES каждого организма.

Мы изменили текст, чтобы удалить спекулятивное утверждение относительно Paramecium центромер, а также утверждение о «фундаментальном различии» между центромерами двух видов и включить ссылку на недавно опубликованное исследование, как было предложено рецензентом.

23) Рисунок 3. Логотип последовательности. В логотипе Cbs не указана частота каждой базы, как указано в легенде. Логотип представлен в виде битов информации. Однако это было неправильно рассчитано. Никакие A или T не могут нести 2 бита информации в геноме, который превышает 75% A + T. Логотип следует рассчитывать с учетом частоты каждой основы в геноме, а не предполагать равные частоты. Это заставит C выделяться намного больше. При использовании seqlogo доступен просмотр «базовой частоты», но результат не такой приятный.

Благодарим рецензента за обнаружение ошибки в легенде рисунка; это было исправлено, чтобы идентифицировать ось Y как биты, то есть как единицы сохранения, а не единицы частоты нуклеотидов. Что касается предложения поднять базовый уровень до уровня общегеномной сохранности, что предлагает рецензент, в этом предложении есть определенная ценность. Но общегеномные частоты (и связанные с ними биты сохранения) включают частоты кодирующих последовательностей, которые имеют содержание G + C выше среднего.Сохранение истинного уровня сохранения некодирующей Cbs-смежной последовательности обеспечивает значимый внутренний контроль. Мы предпочитаем сохранять представление измерений сохранения без каких-либо предположений, что, например, не дает искаженного представления о разнице в сохранении между T в положениях Cbs 1 и 15.

24) В четвертом абзаце подраздела «Сохранение участков хромосомных разрывов у видов Tetrahymena». Я предполагаю, что термин «центрические хромосомы» относится к хромосомам MAC, которые происходят из центральных областей хромосом MIC.По тексту было бы легче следовать, если бы они были названы центрическими MAC-хромосомами. В конце того же абзаца «развязка» правильная или должна быть «развязка»?

После пересмотра термин «центрические хромосомы» больше не появляется в основном тексте, но он был заменен на «центрические хромосомы MAC» в легенде к Таблице 1. В легенде к дополнительному файлу 1E мы также теперь ссылаемся на « Центрические хромосомы MAC, происходящие из центромерных областей хромосом MIC «.Предлагаемое изменение с «разъединения» на «разъединение» было сделано. Это предложение теперь появляется в дополнительном файле 2C.

25) Ссылка Lhuillier-Akakpo et al., 2015 является неполной.

Ссылка исправлена.