Расчет тандем блюм: Расчет ящика для направляющих Tandem Blum

Уважаемые фермеры, агенты, агрономы и другие

Я на самом деле сегодня возвращаюсь в Роли (через Пунго и пляж Ва), но вчера вечером я получил так много писем по электронной почте относительно опубликованных вчера вечером рекомендаций о том, как мы отстаем в «тепловых единицах» в этом году по сравнению с другие сезоны.И я получил несколько вопросов о единицах измерения времени роста и о том, как они могут быть связаны с различными стадиями развития растений, такими как 1-е цветение. Это важный этап по ряду причин, включая тот факт, что некоторые спреи нельзя использовать после начала цветения. На практике я смотрю на первое цветение как на стадию, когда около 5% от общего количества цветков на клубнике на самом деле цветут. Таким образом, на растении с потенциалом дать 60 хороших цветков, тогда 5% цветения будут представлять всего 3 хороших цветка (5% x 60 = 3 цветка).За последние 2 года я наблюдал интересную тенденцию на местной ферме недалеко от Роли, где количество единиц GDD, связанных с 5% цветением, составляет около 90 единиц Growing Degree Day (GDD). Да, требуется гораздо больше исследований по этому поводу, но это может быть хорошим началом сегодня, чтобы просто показать вам, как я рассчитываю GDD с использованием 30-дневного прогноза, чтобы понять, когда мы можем достичь 90 GDD в этом конкретном месте фермы. По сути, сейчас у этой фермы 44 GDD (1 января — 25 февраля), и я просто затем подсчитал, сколько единиц будет накоплено в течение следующих 30 дней с 26 февраля по 27 марта.Но давайте сделаем паузу и просто обсудим GDD, поскольку один вопрос, который я получил, касался того, как, возможно, связаны GDD и охлаждающие устройства. Они не!

Итак, чтобы убедиться, что мы все на одной странице, вот хорошее определение GDD из штата Огайо (http://www.oardc.ohio-state.edu/gdd/glossary.htm):

«Дни градуса роста — это измерение роста и развития растений и насекомых в течение вегетационного периода. Развитие не происходит в это время, если температура не превышает минимальное пороговое значение (базовая температура).Базовая температура варьируется для разных организмов. Это определяется путем исследований и экспериментов ».

Однако авторы продолжают заявлять: «Базовая температура 50 градусов по Фаренгейту считается приемлемой для всех растений и насекомых».

Для клубники это базовая температура, которую мы выбрали для использования, и хотя SkyBit фактически позволяет мне использовать другие базовые температуры для местоположения Клейтон, Северная Каролина (например, 45 F, 55 F и т. Д.). Я чувствую базовую температуру 50 F для клубники.

Существует несколько методов расчета GDD, но мы используем простой метод, описанный здесь в бюллетене OSU:

a) Простой метод:

Этот метод сравнивает среднесуточную температуру (T _mean ) с базовой (T _base ) или пороговой температурой. Среднесуточная температура — это средняя дневная максимальная и минимальная температура. Если это среднее значение больше пороговой температуры, GDD, накопленная за этот день, представляет собой пороговую температуру, вычитаемую из средней дневной температуры.Если среднесуточная температура ниже базовой температуры, то GDD для этого дня равен нулю. При сложении GDD всех ранее рассмотренных дней и GDD этого дня вычисляется GDD конкретного дня.

Пример:

• Для моего кооператора по выращиванию в Нэшвилле, Северная Каролина (упоминается в рекомендациях по прошлой ночи), я использовал простой метод для расчета GDD и Base 50. Если AccuWeather близок к тому, чтобы быть правым в их прогнозе дневных максимумов и минимумов за этот 30-дневный период с 26 февраля по 27 марта в этой локации будет только 58.5 GDD

Итак, вспоминая, что у нас было 44 GDD с 1 января по 25 февраля и что мы можем накопить еще 58,5 единиц в следующие 30 дней, то мое прогнозируемое общее накопление единиц GDD за период с 1 января по 27 марта оценивается при 102,5 (44 + 58,5). Как я сказал ранее, мы рассчитываем около 90-92 GDD для 5% цветения, так что это, вероятно, будет примерно 22 марта в этом месте (102,5-13 = 89,5).

Я продолжу это упражнение позже в эти выходные, но пока у меня есть несколько встреч!

Доктор.Э. Барклай Полинг

Специалист по выращиванию мелких фруктов на пенсии

и заслуженный профессор

Кафедра садоводства

Campus Box 7609, 162A Kilgore Hall

Государственный университет штата Северная Каролина
Роли, Северная Каролина 27695-7609

Пессимист видит трудности в каждой возможности, оптимист
видит возможность в каждой трудности. Уинстон Черчилль, премьер-министр Англии

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности.Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки вашего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, используйте кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
• Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в cookie-файлах может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Идентификация новых путей фрагментации и ионных структур фрагментов в тандемных масс-спектрах протонированных синтетических катинонов

Основные моменты

•

Пути (пути), рационализированные для базового пика в тандемных масс-спектрах многих синтетических катинонов.

•

С высокой массовой точностью установлен элементный состав осколков.

•

Мечение изотопов и MS ⁿ установили последовательные пути фрагментации.

•

Ионная спектроскопия и теоретические расчеты подтвердили идентичность предложенных фталатоподобных промежуточных продуктов.

Abstract

Расширяющееся использование новых синтетических наркотиков, таких как синтетические катиноны или «соли для ванн», является растущей проблемой общественного здравоохранения и постоянной проблемой для аналитиков.В тандемных масс-спектрах протонированных α-пирролидинофеноновых катинонов ион тропилия на m / z 91 часто входит в число наиболее распространенных ионов-продуктов, но его механистическое происхождение в настоящее время необъяснимо. Этот проект объединил многоступенчатую масс-спектрометрию с ионизацией электрораспылением (ESI-MS ⁿ ), масс-спектрометрию высокого разрешения (HRMS), изотопное мечение и ионную спектроскопию, чтобы улучшить наше понимание путей и механизмов фрагментации различных α-пирролидинофенонов. катиноны.Тенденции фрагментации, полученные из этих исследований ESI-MS / MS, следующие: 1) в отличие от N -алкилированных катинонов, обильные катион-радикалы не наблюдаются в предшественниках α-пирролидинофенонов с четными электронами; 2) потеря нейтрального пирролидина 71 Да с образованием катиона алкилфенона наблюдается всегда; 3) ряд нейтральных алкенов теряется из катиона алкилфенона с образованием промежуточных катионов с фталаноподобной структурой. Промежуточные соединения фталана затем удаляют карбонильный углерод в виде CO или C ₂ H ₂ O с образованием иона тропилия при м / z 91.Α-углерод исходного катинона почти исключительно сохраняется в ионе тропилия. Если исходный катинон замещен в ароматическом кольце, наблюдаемый ион тропилия будет смещен на массу замещения. Эти результаты объясняют характерные ионы в спектрах ESI-MS / MS синтетических катинонов и помогут аналитикам лучше использовать масс-спектральные наблюдения в будущих исследованиях.

Ключевые слова

Тандемная масс-спектрометрия

Изотопная маркировка

Ионная спектроскопия

Расчеты методом DFT

Катиноны

Рекомендуемые статьиЦитирующие статьи (0)

© 2020 Авторы.Опубликовано Elsevier B.V.

Рекомендуемые статьи

Цитирующие статьи

mMass как программный инструмент для аннотации циклических пептидных тандемных масс-спектров

Abstract

Природные или синтетические циклические пептиды часто обладают выраженной биоактивностью. Их масс-спектрометрическая характеристика затруднена из-за преобладающего присутствия непротеиногенных мономеров и наблюдаемых сложных паттернов фрагментации. Несмотря на то, что несколько программных инструментов для аннотации тандемных масс-спектров циклических пептидов были опубликованы, эти инструменты по-прежнему не могут аннотировать большинство сигналов, наблюдаемых в экспериментально полученных масс-спектрах.Таким образом, они не подходят для обширной масс-спектрометрической характеристики этих соединений. Отсутствие передовых и удобных программных инструментов побудило нас расширить модуль фрагментации свободно доступного программного обеспечения с открытым исходным кодом mMass (http://www.mmass.org), чтобы обеспечить аннотацию тандемных масс-спектров циклических пептидов и интерпретация. Полученное программное обеспечение было протестировано на нескольких цианобактериальных и других природных пептидах. Было обнаружено, что он превосходит другие доступные в настоящее время инструменты как по удобству использования, так и по обширности аннотаций.Таким образом, он очень полезен для ускорения подтверждения структуры и выяснения циклических, а также линейных пептидов и депсипептидов.

Образец цитирования: Niedermeyer THJ, Strohalm M (2012) mMass как программный инструмент для аннотации тандемных масс-спектров циклических пептидов. PLoS ONE 7 (9): e44913. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0044913

Редактор: Джон Мэтью Кумен, Онкологический центр Моффитта, Соединенные Штаты Америки

Поступила: 15.05.2012; Принята к печати: 9 августа 2012 г .; Опубликован: 13 сентября 2012 г.

Авторские права: © Niedermeyer, Strohalm.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Эта работа была поддержана Чешским научным фондом (P206 / 12/1150), Министерством образования, молодежи и спорта Чешской Республики (ME10013). Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных или подготовке рукописи.Дополнительного внешнего финансирования для этого исследования не получено.

Конкурирующие интересы: Тимо Нидермейер — сотрудник Cyano Biotech GmbH. Однако описанное программное обеспечение не было разработано в Cyano Biotech, и компания не имеет в нем каких-либо финансовых интересов. Нет никаких патентов, продуктов в разработке или продаваемых продуктов, которые можно было бы декларировать. Это не влияет на соблюдение авторами всех политик PLoS ONE в отношении обмена данными и материалами, как подробно описано в руководстве для авторов.Cyano Biotech GmbH дала TN разрешение на публикацию рукописи.

Введение

Циклические пептиды — это группа натуральных продуктов, которая привлекает интерес большого числа исследователей из-за их интригующей структуры и мощной и разнообразной биоактивности. Циклические пептиды обнаружены во многих штаммах бактерий и грибов [1], [2]. В особенности цианобактерии давно известны из-за обилия циклических пептидов и циклических депсипептидов, которые они производят [3] — [6].Эти соединения могут иметь рибосомное происхождение (например, микровиридины, обнаруженные в штаммах Microcystis ) [7], [8], но преимущественно они синтезируются нерибосомными пептидными синтетазами (NRPS) [9] — [12]. Нерибосомные пептиды интересны химикам, специализирующимся на натуральных продуктах, поскольку они не только состоят из протеиногенных аминокислот, но также содержат необычные и сильно модифицированные аминокислоты или мономеры, созданные поликетидсинтазами (PKS). Эти соединения часто происходят из смешанного пути биосинтеза PKS / NRPS, как подробно описано e.грамм. для цианобактериальных микроцистинов [13] — [15]. В отличие от 20 протеиногенных аминокислот, более 500 различных мономеров могут быть составлены из известных нерибосомных пептидов и общедоступны в базе данных NORINE [2], [16]. Тем не менее, в литературе описываются дополнительные мономеры.

Среди наиболее ярких примеров фармацевтически используемых нерибосомных циклических пептидов — циклоспорин, иммунодепрессант из Tolypocladium inflatum [17], [18], и ванкомицин, антибиотик из Amycolatopsis orientalis [19], [20], [20].Несколько других соединений или смесей соединений либо используются напрямую (например, тиротрицин, даптомицин и актиномицин D), либо служат в качестве ведущих структур для текущей разработки лекарств (например, криптофицины) [21].

Структурная характеристика вновь выделенных или синтезированных биоактивных циклических пептидов является основой для их дальнейшего использования. Масс-спектрометрия часто служит ценным инструментом на первых этапах дерепликации, подтверждения структуры и выяснения циклических пептидов, когда ограниченное количество материала затрудняет прямую характеристику с помощью ЯМР-спектроскопии.

Для проверки предложенных структур обычно используется теоретическая фрагментация in-silico для сравнения с экспериментальными данными. Изучив свободно доступное программное обеспечение, которое можно использовать для in-silico фрагментации циклических пептидов и аннотации их тандемных масс-спектров, мы обнаружили, что, несмотря на общий интерес к этим соединениям, доступные в настоящее время биоинформатические инструменты не позволяют удобно и эффективно назначать тандемных масс-спектров циклических пептидов.Исходя из потребностей ученых-протеомиков, многие программные инструменты для in-silico фрагментации и аннотации линейных пептидов были разработаны на основе наблюдаемого поведения пептидов при газофазной фрагментации [22] — [26] и теоретических аспектов расчета фрагментации [ 27] — [31]. Эти инструменты, однако, не обязательно подходят для химиков, занимающихся натуральными продуктами, или химиков-синтетиков, работающих с циклическими пептидами.

Большинство доступных инструментов с графическим пользовательским интерфейсом (GUI; e.грамм. ProteinProspector [32], InSilicoSpectro [33], [34], Proteomics Toolkit [35], PeptideART [36], mMass [37]) подходят для фрагментации и аннотации линейных пептидов in-silico , но не предлагают такая же функциональность для циклических пептидов. Кроме того, для сборки пептидной последовательности можно использовать в основном протеиногенные аминокислоты, а поддержка необычных мономеров очень ограничена. Хотя некоторые модификации могут быть применены к выбираемым аминокислотам, эта особенность обычно ограничивается обычно встречающимися модификациями и не отражает богатство небелковых мономеров, встречающихся в нерибосомных пептидах.И последнее, но не менее важное: некоторые из программ, упомянутых выше, являются веб-инструментами, демонстрирующими врожденные недостатки, обсуждаемые ниже.

Накоплены обширные знания о путях фрагментации линейных пептидов [22] — [26]. Хотя фрагментация циклических пептидов не так хорошо изучена, она также достаточно хорошо изучена и будет описана более подробно ниже. Следовательно, должна быть осуществима трансляция путей циклической фрагментации пептидов в программный алгоритм.Насколько нам известно, сегодня бесплатно доступны только три программных инструмента, способных выполнять фрагментацию in-silico циклических пептидов.

massXpert2 — это мощное программное обеспечение для обработки полимеров [38], которое также подходит для фрагментации циклических пептидов in-silico . Однако его многофункциональный пользовательский интерфейс может отпугнуть начинающего пользователя. Кроме того, программное обеспечение требует глубокого понимания механизмов фрагментации, поскольку пользователю необходимо вручную определить возможные пути фрагментации.

PFIA было первым программным обеспечением, специально разработанным для in-silico фрагментации циклических пептидов [39]. Это программное обеспечение с открытым исходным кодом, которое можно использовать как автономный инструмент. Программное обеспечение легко установить, а пользовательский интерфейс прост и интуитивно понятен. Последовательности пептидов можно вводить и сохранять. Аминокислоты можно модифицировать с помощью ограниченного набора предопределенных модификаций. Основным недостатком является то, что — помимо только 12 предопределенных непротеиногенных аминокислот — пользователь может добавить не более четырех пользовательских аминокислот.Это ограничивает возможность использования для анализа нерибосомных пептидов, так как во многих циклических пептидах этого типа обнаружено более четырех необычных аминокислот. Еще одним недостатком программного обеспечения является то, что можно рассчитать только ионы a-серии, b-серии и ионы иммония, при этом нейтральные потери и другие серии фрагментации не учитываются. Наконец, экспериментальные данные не могут быть импортированы, поэтому невозможно автоматическое сопоставление рассчитанных фрагментов с полученными данными.

Самый последний программный инструмент, MS-CPA [40], был усовершенствован с момента его первой публикации в 2009 году и был переименован в NRP-Annotation (P.А. Певзнер, кадровое сообщение 07.09.2011). Для этой программы локальная установка невозможна, но это исключительно веб-инструмент, который создает ряд недостатков для пользователя. Доступность программы не может быть гарантирована всегда, так как для этого требуется активное подключение к Интернету и рабочий сервер, на котором размещена программа. Пользователь не может полагаться на воспроизводимость, поскольку версия программного обеспечения может быть изменена сопровождающим без какого-либо уведомления, а предыдущие версии программы теряются для пользователя (например,грамм. опубликованная версия MS-CPA больше не доступна). Необработанные данные экспериментов должны быть загружены на сервер, что может помешать ученым анализировать более конфиденциальные данные, которые они не хотят передавать третьим лицам. NRP-Annotation позволяет свободно вводить массы мономеров для составления последовательности, которая позволяет вводить все мыслимые мономеры. Однако, поскольку программа представляет собой веб-инструмент, данные мономера необходимо вводить для каждого использования заново. Невозможно сохранить и повторно использовать введенные мономеры или последовательности для будущих сеансов.Это наиболее неудобно, если, например, Необходимо рассчитать характер фрагментации для структурно родственных соединений, а массы всех мономеров всех структур необходимо ввести индивидуально и многократно. Программа не является программой с открытым исходным кодом, поэтому ее нельзя изменять в соответствии с индивидуальными потребностями. Для расчета должен быть представлен масс-спектр, однако принимаются только файлы в формате .dta, тогда как предыдущая версия, MS-CPA, также принимала формат.mzXML. Более того, пользователь не может повлиять на обработку загруженных масс-спектров.После первоначальной обработки рассчитанные фрагменты сопоставляются с пиками, наблюдаемыми в спектре. Это приводит к некоторым статистическим данным, аннотированному спектру, списку пиков и совпадений и графику ошибок в качестве выходных данных. Учитываются серии a и b, а также реакции скремблирования последовательности, нейтральные потери воды и аммиака и аддукты монооксида углерода. Может сбить с толку тот факт, что во всех отчетах, предоставляемых программным обеспечением, вместо измеренных значений m / z используются значения массы незаряженных фрагментов (т.е.без массы каких-либо дополнительных заряженных протонов).

Таким образом, все доступные программные решения имели существенные недостатки и не могли быть эффективно использованы для наших целей. Следующие функции необходимы для желаемого инструмента аннотации:

• автономный инструмент, работающий в нескольких операционных системах,
Возможности обработки и обработки спектра
• (например, поддержка различных форматов данных, коррекция базовой линии, выбор пиков и т. Д.),
• возможность сохранять спектры, последовательности и результаты интерпретации для будущего использования,
База данных мономеров
• и редактор для удобного управления мономерами и последовательностями,
• включение как можно большего числа известных путей фрагментации циклических пептидов,
• настраиваемых нейтральных потерь с учетом потерь боковой цепи,
• скидка на множественные нейтральные потери от одного осколка,
• сопоставление и аннотация экспериментальных данных.

Материалы и методы

Соединения и подготовка проб

Микроцистин LF, микроцистин LR, криптофицин-1 и микрогинин FR1, соединения, выделенные из цианобактерий, были получены из библиотеки чистых природных продуктов Cyano Biotech GmbH, Берлин, Германия. Соединения растворяли до концентрации 5 мкг / мл в смеси метанол: вода 50-50. Экспериментальные данные для сеглитида и цикломарина A были загружены с веб-страницы NRP (http://bix.ucsd.edu/nrp/; данные IT (авто) для сеглитида, данные TOF для цикломарина A) 15 сентября 2011 г.Структуры соединений показаны на рисунке 1.

Жидкостная хроматография — масс-спектрометрия

МС были получены с использованием ВЭЖХ, соединенной с масс-спектрометром IT-TOF (Shimadzu Europe GmbH, Дуйсбург, Германия) с использованием ионизации электрораспылением в положительном режиме, и были оценены с использованием программного обеспечения поставщика LCMSSolution версии 3.60.361 с Formula Predictor версии 1.13. Соединения разделяли на колонке Kinetex C ₁₈ (2,6 мкм, 100 × 3 мм, phenomenex, Торранс, США) с использованием градиента от 5 до 80% ацетонитрила в воде в течение 25 мин (0.1% муравьиной кислоты добавлен в качестве модификатора). Ионы-предшественники, соответствующие [M + H] ⁺ , были изолированы в ионной ловушке, фрагментированы в результате диссоциации, индуцированной столкновением (CID), с использованием аргона в качестве газа столкновения (энергия столкновения установлена ​​на 150%, газ столкновения — на 100%, и q (частота ) до 45,0 кГц) и разделены в анализаторе TOF. Сканы MS / MS были усреднены и преобразованы в формат mzXML с использованием программного обеспечения производителя. Для расчета формул суммы использовалась моноизотопная масса, усредненная по крайней мере из трех сканирований.Указанные в тексте значения Δ представляют собой отклонения теоретических масс обсуждаемых фрагментов и экспериментально определенных масс в ppm.

Сравнение с аннотацией NRP

данных МС были импортированы в mMass, и пики были выбраны вручную. Полученный список пиков был сохранен в формате файла .dta и загружен на сервер NRP-Annotation. NRP-Annotation фильтрует пики согласно не описанному алгоритму. Чтобы обеспечить справедливое сравнение между двумя программными инструментами, список пиков в mMass был вручную уменьшен, чтобы содержать только пики, которые также были оценены NRP-Annotation.

Дизайн программного обеспечения и реализованные пути фрагментации

Расширение существующей программы масс-спектрометрии.

При поиске программного инструмента, удовлетворяющего как можно большему количеству критериев, описанных выше, один из авторов (TN) определил программное обеспечение mMass как наиболее подходящую основу для дальнейшей разработки. mMass — это портативное кроссплатформенное программное обеспечение с открытым исходным кодом для обработки масс-спектров, написанное в основном на Python [37], которое уже предлагало графический интерфейс, возможности манипулирования спектром, возможность ввода и сохранения пептидных последовательностей и in-silico фрагментация и аннотация спектра.Однако введение и фрагментация пептидов ограничивались линейными последовательностями и протеиногенными аминокислотами, и отсутствовала редактируемая пользователем база данных мономеров, а также несколько вариантов фрагментации, важных для циклических пептидов. Поскольку mMass является открытым исходным кодом, программное обеспечение может быть изменено для соответствия всем критериям, описанным выше.

Прежде всего, был разработан редактор библиотеки мономеров, дающий пользователю возможность удобно вводить, редактировать и сохранять мономеры, необходимые для композиции пептидных последовательностей.Библиотека была заполнена всеми мономерами, собранными из базы данных NORINE [16], что облегчает ее использование для новых пользователей и позволяет легко добавлять собственные варианты. Кроме того, редактор мономеров позволяет определять возможные нейтральные потери отдельных мономеров.

Во-вторых, организация последовательностей и обработка были расширены, чтобы сделать возможным состав пептидов, содержащих непротеиногенные аминокислоты. Для этой цели был разработан дополнительный редактор последовательностей, который позволяет удобно составлять пептиды путем ввода или перетаскивания мономеров из библиотеки мономеров прямо в редактор.Кроме того, пептид может быть линейным или циклическим.

Наконец, модуль фрагментации был улучшен для обработки всех возможных известных путей фрагментации циклических пептидов, чтобы учесть потерю нестандартных нейтралов и учесть множественные потери нейтралов из одного фрагмента.

Чтобы оценить возможности полученного программного пакета, несколько спектров цианобактериального природного продукта MS ² были аннотированы, и аннотации были сопоставлены с аннотациями, сделанными NRP-Annotation.

Пути фрагментации основной цепи.

Циклические пептиды известны своим начальным разрывом амидных связей, приводящим к образованию всех возможных линейных последовательностей b-ионов, имеющих свободный N-конец и, как известно для b-ионов, оксазолоновый «C-конец» [ 25], [41], [42]. Поскольку все первоначально образованные b-ионы имеют оксазолоновый «C-конец», x-, y- и z-ионы, возможно, возникающие в результате дальнейшей фрагментации этих предшественников, не имеют C-конца свободной карбоновой кислоты, обычно обнаруживаемого в этих типах ионов. .Поэтому в этой публикации они называются y-подобными, x-подобными и z-подобными ионами. Сводка возможных путей фрагментации позвоночника представлена ​​на рисунке 2, на примере Microcystin LF.

Фиг. 2. Типичные пути фрагментации остова циклического пептида.

После начального разрыва случайной амидной связи Microcystin LF (1) образующийся b-ион может подвергаться дальнейшей фрагментации, в результате чего образуются a / x-подобные, b / y-подобные или c / z-подобные ионы.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0044913.g002

b- и y-образные фрагменты-ионы.

Линейные b-ионы, образующиеся в результате начального расщепления, могут — как это хорошо известно для линейных b-ионов — подвергаться дальнейшей фрагментации по пути b _x -b _{x – 1} с образованием других ионов соответствующего b- ряд. Фрагментация также может продолжаться по пути b _x -y _z , приводя к соответствующей y-серии [26]. Однако, поскольку исходный фрагмент y-ряда, как и b-ионы, имеет оксазолоновый «C-конец», а не свободную карбоновую кислоту, ионы y-ряда неотличимы от идентичных b-ионов, происходящих из ab _x -b _{x – 1} фрагментация другого линейного предшественника того же циклического пептида.Для полноты расчет y-подобных ионов был включен в mMass, хотя для каждого y-подобного иона существует структурно соответствующий b-ион.

а- и х-подобных фрагментов ионов. Известно, что

b-ионов теряют CO с образованием соответствующих a-ионов по пути b _x -a _x [26], который также часто описывается для циклических пептидов [42] — [45]. Формирование x-подобных ионов механически возможно, поэтому этот ряд ионов также был включен в программное обеспечение, хотя, насколько нам известно, эти ионы еще не были описаны для циклических пептидов.

c- и z-образных фрагментов ионов.

Фрагментация c-типа предшественников b-ионов механически возможна и была описана для микроцистинов [46], [47]. То же самое верно и для z-подобных фрагментов [47], которые в случае циклических пептидов равны y-подобным ионам NH ₃ или b-NH ₃ по формуле их суммы. Однако они были включены в программное обеспечение, потому что они должны быть доведены до сведения пользователя, если не выбраны параметры для расчета y-подобных ионов или потерь NH ₃ из b-ионов, и потому что NH ₃ потеря от y-подобных или b-ионов не ограничивается N-концевой аминогруппой, тогда как в случае z-подобных ионов концевая аминогруппа всегда теряется.

Альтернативное начальное раскрытие кольца.

b + CO- и c + CO-ионы часто описывались [40], [45], [48], [49]. Хотя механизм их образования еще недостаточно изучен, Эккарт [42] предложил следующий путь: помимо начального образования b-ионов, расщепление связи C _α -C _{карбонил} в Также возможен a / x-подобный способ, приводящий к соответствующим ионам N-формилммония. Последующая потеря аминовых фрагментов приводит к образованию ионов, которые формально можно описать как «аддукты СО».Предлагаемый механизм образования иона + CO, наблюдаемый в рамках этого исследования, показан на рисунке 3. Формильная группа присоединена к N-концу, таким образом, только ионы a-, b- и c-типов могут показывать это формальное присоединение. CO. Добавление CO к иону a-типа приводит к иону с той же формулой суммы, что и соответствующий b-ион, и поэтому его нельзя различить в экспериментах MS ² .

Рис. 3. Предлагаемый путь образования наблюдаемого иона N-формильного фрагмента.

Первоначальное протонирование D-аланином микроцистина LF (1) и последующие реакции 1 и 2 приводят к образованию наблюдаемого иона N-формильного фрагмента (3).1) Распад до N-формил-иона (2). 2) c-образная фрагментация и потеря воды.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0044913.g003

Скремблирование последовательности.

Скремблирование последовательностей a- и b-ионов — это явление, которое недавно было описано и изучено более подробно [50] — [56]. Это также наблюдалось в случае циклических пептидов [40], [45], [57]. Механизм такого скремблирования последовательностей, согласно цитируемым публикациям, будет следующим. 1) Начальное расщепление циклического пептида до b-иона, как описано выше.2) Фрагментация полученного линейного пептида. 3) Рециклизация полученного фрагмента b- или a-иона путем нуклеофильной атаки N-концевого азота на C-концевой карбонильный углерод в случае b-ионов или на углеродный центр C-концевого иона иммония в случай a-ионов. 4) Повторное открытие полученного циклического пептида по другой пептидной связи. 5) Фрагментация полученного линейного пептида. Скремблирование последовательностей может привести к множеству идентичных последовательностей, например для циклического пептида с семью мономерами образование 14 идентичных b ₂ -ионов возможно по разным путям.Для ясности был реализован алгоритм фильтрации, который удаляет все ионы с идентичной последовательностью, но ион, образованный по простейшему пути. Как показано в Примере S1, скремблирование последовательности in-silico YAGFL-NH ₂ с использованием нашего алгоритма соответствует экспериментальной фрагментации, описанной в литературе [51], [58]. Программа не учитывает возможные реакции скремблирования последовательности через боковые цепи [59].

Нейтральные потери.

Потеря H ₂ O или NH ₃ — обычное явление, обнаруживаемое для циклических пептидов, даже если в молекуле отсутствуют гидроксильные группы [40], [44], [46], [48], [ 60] — [64].Одновременная потеря H ₂ O и NH ₃ возможна, а также наблюдались потери нейтрали боковой цепи в сочетании с H ₂ O или NH ₃ потери [27], [45], [47]. Нейтральные потери боковой цепи обычно наблюдаются при диссоциации с захватом электрона (ECD), диссоциации с переносом электрона (ETD) и диссоциации, вызванной столкновением высоких энергий (CID) [65] — [68]. Они реже наблюдаются для низкоэнергетических CID [23], [69], [70], но для этого метода диссоциации также было описано несколько нейтральных потерь в боковой цепи, например.грамм. нейтральные потери от аргинина [47], [71] — [73], непротеиногенной аминокислоты Adda ((2S, 3S, 8S, 9S) -3-амино-9-метокси-2,6,8-триметил- 10-фенил-дека-4,6-диеновая кислота) [46], [47] или другие модифицированные аминокислоты [74]. Из-за возможного возникновения этих потерь mMass теперь дает пользователю возможность свободно определять нейтральные потери боковой цепи. Однако, поскольку авторы не используют ECD / ETD, потери, характерные для этих методов, еще не включены в базу данных мономеров. Пользователям предлагается добыть упомянутые ссылки и ввести потери с помощью встроенного редактора мономеров.

Прибыли.

Формальное присоединение H ₂ O к b-ионам было описано и механистически обсуждено [57], [73], [75]. Возможные пути образования этих ионов в случае криптофицина-1 обсуждаются ниже и показаны на рисунке 4.

Рис. 4. Предлагаемый механизм образования наблюдаемых ионов b + H ₂ O.

b + H ₂ Ионы фрагмента O (2a) и (2b) криптофицина-1 (1) могут быть результатом двух путей раскрытия кольца: прямого c / z-подобного расщепления циклического пептида или b / y-подобного расщепление с последующим переносом ОН.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0044913.g004

Номенклатура.

Номенклатура циклических пептидных фрагментов, предложенная Ngoka и Gross [76], основанная на модификации Биманна [77] номенклатуры Roepstorffs [78], подходит для циклических пептидных фрагментов, содержащих в основном протеиногенные аминокислоты. Однако, если пептид в основном состоит из непротеиногенных аминокислот, маркировка становится запутанной из-за многобуквенных сокращений мономеров.Таким образом, это программное обеспечение указывает начальный сайт расщепления с помощью чисел, аналогично подходу, предложенному Егоровым и соавт. [79]. Поскольку программное обеспечение уже использовало символ «-» в другом контексте, мы решили использовать символ «|» вместо этого оптически указывает на разрыв связи между двумя мономерами циклического пептида. Таким образом, например, 6 мономеров, содержащих b-ион циклического пептида, первоначально расщепленного между первым и вторым мономером, помечены b _{6 [1 | 2] [1]} — _[6] , 1 — новый C-концевой оксазолон. и 2 новый N-конец.Скремблирование последовательности усложняет номенклатуру, так как должны быть описаны два раскрытия кольца и промежуточный этап фрагментации. Если, например, фрагмент b _{6 [2 | 1] [1]} — _[6] рециклируется, повторно открывается, впоследствии расщепляется после нового положения 2 и теряет еще одну аминокислоту, фрагмент помечен b _{5 [1 | 2] [1]} – _{[6] [2 | 3] [1]} – _[5] . Таким образом, наша номенклатура индекса ионных фрагментов интуитивно резюмирует полную историю образования фрагментов.В пользовательском интерфейсе полные последовательности фрагментов приведены в таблице фрагментов с использованием соответствующих сокращений мономеров.

Результаты и обсуждение: оценка программного обеспечения

Experimental и

Несколько соединений были подвергнуты анализу MS ⁿ , как описано выше, и полученные тандемные масс-спектры были аннотированы с использованием как NRP-Annotation, так и новой версии mMass. Результаты этого сравнения описаны ниже и суммированы в таблице 1.Тандемные масс-спектры показаны на рисунке 5. Необработанные данные (данные S1), а также отчеты анализа аннотаций соединений, обсуждаемых ниже (пример S2), можно найти во вспомогательной информации.

Рис. 5. Тандемные масс-спектры микроцистина LF и криптофицина-1.

(А) микроцистин LF, (Б) криптофицин-1. Обсуждаемые в тексте сигналы отмечены звездочкой (закрашенная звезда: без аннотации NRP-Annotation).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0044913.g005

Циклический пептидный микроцистин LF

Фрагментационное поведение микроцистинов, циклических гептапептидов, обнаруженных у нескольких родов цианобактерий, хорошо изучено [46], [47], [60], [80], [81]. Таким образом, микроцистин LF был использован для проверки точности и полноты наших алгоритмов фрагментации. К нашему удивлению, NRP-Annotation отфильтровала несколько значимых и важных пиков из загруженных необработанных данных. Кроме того, аннотировано только относительно небольшое количество пиков (в сумме до 23% общей интенсивности пика после фильтрации).Некоторые из наиболее частых сигналов, включая базовый пик, не были назначены. Таким образом, мы провели сравнительное исследование с использованием новых алгоритмов mMass. Включая в наши расчеты по аналогии с NRP-Annotation только a- и b-ионы, скремблирование последовательности и простые нейтральные потери H ₂ O и NH ₃ , мы получили идентичные отнесения. Включая также ионы M-, c-, x- и z-типов, соответствовали еще 26% общей интенсивности пика. Включение опции для ионов N-формила привело к дальнейшему увеличению согласованной интенсивности на 10%.Допущение определяемых пользователем нейтральных потерь, описанных для фрагмента Адда, как обсуждалось выше, увеличило квоту согласования еще на 26%. Включение нескольких нейтральных потерь увеличилось на 10%, в результате чего общая аннотированная пиковая интенсивность составила 96%.

Тандемный масс-спектр микроцистина LF показывает несколько значимых пиков, которые не были присвоены NRP-аннотацией, но были аннотированы mMass (рисунок 5A). Ионы-фрагменты, наблюдаемые при m / z 478,2644 и m / z 561,3017, были аннотированы как c-ионы c _{4 [7 | 1] [1]} — _[4] (Δ 3.3 ppm) и c _{5 [6 | 7] [1]} — _[5] (Δ 2,5 ppm), соответственно. Z-подобный ион с нейтральными потерями, z _{5 [2 | 3] [3]} — _[7] -C ₉ H ₁₀ O, при m / z 559,3127 (Δ 0,2 ppm ) часто описывается для Adda-содержащих микроцистинов [47], [60]. Соответствующий ион без нейтральной потери, z _{5 [2 | 3] [3]} — _[7] наблюдается при m / z 693,3816 (также обозначен NRP-Annotation как b-NH ₃ -ион ; Δ 3.1 м.д.).Базовый пик спектра при m / z 852,4486 был аннотирован как MC ₉ H ₁₀ O по мМасс (Δ 1,9 ppm), что показывает, насколько важно учитывать определяемые пользователем нейтральные потери и включать ионы M в расчеты. Другой значительный пик наблюдался при m / z 835,4252, обозначенный mMass как MC ₉ H ₁₀ O-NH ₃ (Δ 1,9 ppm), что указывает на то, что фрагменты с множественными потерями нейтрали могут составлять значительную часть общая пиковая интенсивность.Ионы N-формила были отнесены к ряду b- и c-подобных ионов с помощью mMass; предложенный механизм образования заметного с-иона N-формила при m / z 801,4549, c _{5 [7 | 1]} [ _1] — _[5] -H ₂ O + CO (Δ 0,5 ppm), показано на рисунке 3. Чтобы подтвердить сделанные примечания, выбранные ионы были подвергнуты MS ³ . Полученные спектры ионов-продуктов и их интерпретация представлены на рисунке S1.

Циклический депсипептид криптофицин-1

NRP-Annotation снова фильтрует многие значимые пики из загруженного спектра MS ² , используя свой не описанный алгоритм.Базовый пик спектра, а также другие пики значительной интенсивности не аннотированы (рисунок 5B). Анализ с помощью mMass показывает, что основной пик при m / z 218,1384 представляет собой водный аддукт иона серии b, b _{2 [2 | 3] [1]} — _[2] + H ₂ O (Δ 1,4 м.д.). Фактически, водный аддукт фрагмента иона b _{3 [1 | 2]} [ _1] — _[3] , содержащий еще один мономер, обнаруживается в спектре при m / z 429,1782 (Δ 1.2 ppm), хотя и с меньшей интенсивностью.С-конец свободной карбоновой кислоты может быть результатом двух гипотетических путей раскрытия кольца: либо прямым c / z-подобным расщеплением циклического пептида, либо b / y-подобным расщеплением с последующим переносом OH, как было предложено Fang et al. [75] и изображены на рисунке 4. Поскольку все депсипептиды после начального расщепления b / y-типа обладают свободной группой ОН, которая может служить донором ОН, или свободной карбоновой кислотой после расщепления c / z-типа, мы ожидаем, что b + H ₂ Ионы O будут обычно наблюдаемыми ионами для всех депсипептидов.Таким образом, для интерпретации спектров депсипептида MS ² важно, чтобы эта опция была доступна в программном обеспечении, используемом для аннотирования спектров. Третий по интенсивности пик с m / z 410.1512 также не был отнесен NRP-Annotation. mMass присвоил этому пику значение _{2 [4 | 1]} [ _1] — _[2] -H ₂ O (Δ 1,2 м.д.). Это подчеркивает важность учета нейтральных потерь от всех типов исходных ионов-фрагментов. Соответствующий a-ион без потери воды также наблюдается с меньшим содержанием при m / z 428.1628 (Δ 1,4 м.д.). Спектры основных обсуждаемых сигналов MS ³ и их интерпретация показаны на рисунке S1.

Другие циклические пептиды

Поскольку наши распределения фрагментов, наблюдаемых для микроцистинов LF и криптофицина-1 с использованием mMass, были довольно обширными, мы также сравнили аннотации масс-спектров других циклических пептидов, а именно микроцистина LR, сеглитида и цикломарина A. Для микроцистина LR мы снова обнаружили более краткая аннотация с использованием mMass.Однако NRP-Annotation определил более высокий процент интенсивности пика для этого соединения, чем для микроцистина LF; из-за локализованного заряда аргинина b-ионы, содержащие аргинин, обнаруживают большое количество. Экспериментальные данные, доступные для сеглитида, представляют собой данные ионных ловушек с низким разрешением; это приводит к очень разнообразным аннотациям при использовании mMass с допуском пика 0,2 Да, что приводит к аннотации пиковой интенсивности, близкой к 100%. Данные с более высоким разрешением, возможно, позволили бы избежать неоднозначной аннотации сигналов, но эти данные не были доступны на веб-сайте NRP-Annotation.Тандемный масс-спектр сеглитида интерпретировать намного легче, чем спектр других соединений, поскольку сеглитид содержит только одну непротеиногенную аминокислоту. В случае цикломарина А авторы MS-CPA использовали допуск по массе 0,1 Да, хотя данные были получены с использованием анализатора TOF. Опять же, mMass смог аннотировать почти каждый пик в спектре.

Линейный пептидный микрогинин FR-1

Для изучения пригодности программного обеспечения для фрагментации in-silico линейных нерибосомальных пептидов микрогинин FR-1 служил модельным соединением.Программа эффективно аннотировала почти все наблюдаемые пики. В связи с тем, что это соединение является линейным пептидом, фрагментация намного проще, и ее также можно было бы выполнить с помощью другого программного обеспечения, подходящего для фрагментации линейных пептидов in-silico , позволяющего определять индивидуальные мономеры. Тем не менее, mMass предлагает более широкие возможности фрагментации, чем большинство других доступных программ, и позволяет очень удобно обрабатывать нерибосомные пептидные мономеры и составлять последовательности, и, таким образом, также может быть программным обеспечением выбора для аннотации линейных пептидных тандемных масс-спектров.

Выводы

Поскольку доступные в настоящее время программные инструменты для аннотации тандемного масс-спектра циклических пептидов нельзя было использовать для полной аннотации спектра, мы значительно расширили свободно доступное программное обеспечение с открытым исходным кодом mMass, чтобы обеспечить необходимые функции. Программа, насколько нам известно, является наиболее лаконичным инструментом, доступным на сегодняшний день для аннотации тандемного масс-спектра циклических, а также нерибосомных пептидов, и доказала свою пригодность к использованию.Благодаря открытому характеру программного обеспечения пользователи могут вносить свой вклад. Это особенно верно для библиотеки мономеров, где отдельным пользователям предлагается поделиться своими собственными расширенными базами данных мономеров.

Используя собственные наборы экспериментальных данных, а также данные, полученные от других ученых, изучавших in-silico фрагментацию циклических пептидов, мы показали, что для всех исследованных пептидов наши алгоритмы смогли определить> 80% общей наблюдаемой пиковой интенсивности. и что программа одинаково хорошо подходит для аннотации циклических депсипептидов и ионов линейных пептидных фрагментов.Назначения, выполняемые mMass, более обширны, чем у всех других доступных в настоящее время программных инструментов для этой цели.

мМасса не подходит для предсказания тандемных масс-спектров циклических пептидов, поскольку невозможно рассчитать интенсивности ионов фрагментов. Но поскольку знания об интенсивности нерибосомных пептидных фрагментов, и тем более о циклических пептидных фрагментах, являются рудиментарными и сильно зависят от типа используемого инструмента, это нелегко реализовать в настоящее время.Кроме того, программное обеспечение не может проверить, могут ли рассчитанные фрагменты наблюдаться в экспериментальных условиях. Таким образом, полученные аннотации требуют внимательной оценки аналитика, но это верно для всех программных решений. Прогноз фрагментации еще не был расширен, чтобы также включить разветвленные циклические пептиды или пептиды с более чем одним циклом.

В использованных наборах данных некоторые сигналы все еще оставались неназначенными. Более тщательное изучение этих пиков может выявить новые механизмы фрагментации циклических пептидов, которые могут быть добавлены в любую будущую версию mMass.

Программное обеспечение можно удобно использовать на ранних этапах выяснения структуры / дерепликации (сопоставление in-silico фрагментации соединений в базах данных с экспериментальными тандемными МС-спектрами) и в качестве одного из последних этапов подтверждения структуры (степень присваиваемых пиков) . Типичный рабочий процесс для аннотации тандемного масс-спектра представлен в Примере S3.

Наличие

мМасса 5.2.0.

Исходный код Python, исполняемые файлы для MS Windows, Mac OS X и Linux, а также тестовые данные можно бесплатно загрузить с веб-страницы проекта http: // www.mmass.org. Исполняемые файлы не требуют установки. Все загружаемые пакеты содержат подробное руководство.

Благодарности

Мы благодарим Мод Пупен и команду базы данных NORINE за предоставление нам набора данных по мономерам. TN благодарит Роберта Гизеке за поддержку Python.

Вклад авторов

Задумал и разработал эксперименты: THJN. Проведены эксперименты: THJN. Проанализированы данные: THJN. Написал статью: THJN MS. Запрограммированное расширение прототипа mMass: THJN.Доработал программный код и внедрил его в новую версию mMass: MS.

Список литературы

1. 1. Тибурзи Ф., Виска П., Импери Ф. (2007) Встречаются ли нерибосомные пептидные синтетазы у высших эукариот? IUBMB Life 59: 730–733.
2. 2. Caboche S, Leclère V, Pupin M, Kucherov G, Jacques P (2010) Разнообразие мономеров в нерибосомных пептидах: к предсказанию происхождения и биологической активности. J Bacteriol 192: 5143–5150.
3. 3.Сайнис И., Фокас Д., Варели К., Цакос А.Г., Коннис В. и др. (2010) Цианобактериальные циклопептиды как ведущие соединения в новых таргетных противораковых препаратах. Мар наркотики 8: 629–657.
4. 4. Намикоши М., Райнхарт К.Л. (1996) Биоактивные соединения, продуцируемые цианобактериями. J Ind Microbiol Biotechnol 17: 373–384.
5. 5. Джаспарс М., Лоутон Л.А. (1998) Цианобактерии — новый источник фармацевтических препаратов. Curr Opin Drug Discov Devel 1: 77–84.
6. 6. Sielaff H, Christiansen G, Schwecke T (2006) Натуральные продукты из цианобактерий: использование нового источника для открытия лекарств.IDrugs 9: 119–127.
7. 7. Ziemert N, Ishida K, Liaimer A, Hertweck C, Dittmann E (2008) Рибосомный синтез трициклических депсипептидов в цианобактериях, образующих цветение. Angew Chem Int Ed Engl 47: 7756–7759.
8. 8. Веласкес JE, ван дер Донк WA (2011) Извлечение генома для синтезированных рибосомами натуральных продуктов. Curr Opin Chem Biol 15: 11–21.
9. 9. Marahiel MA (2009) Работа вне правил синтеза белка: понимание нерибосомного пептидного синтеза.J Pept Sci 15: 799–807.
10. 10. Schwarzer D, Finking R, Marahiel MA (2003) Нерибосомальные пептиды: от генов к продуктам. Nat Prod Rep 20: 275–287.
11. 11. Strieker M, Tanović A, Marahiel MA (2010) Нерибосомальные пептидные синтетазы: структуры и динамика. Curr Opin Struct Biol 20: 234–240.
12. 12. Finking R, Marahiel MA (2004) Биосинтез нерибосомных пептидов. Annu Rev Microbiol 58: 453–488.
13. 13. Тиллетт Д., Диттманн Э., Эрхард М., фон Дёрен Х., Бёрнер Т. и др.(2000) Структурная организация биосинтеза микроцистина в Microcystis aeruginosa PCC7806: интегрированная система пептид-поликетидсинтетаза. Chem Biol 7: 753–764.
14. 14. Диттманн Э., Нейлан Б.А., Бёрнер Т. (2001) Молекулярная биология биосинтеза пептидов и поликетидов у цианобактерий. Appl Microbiol Biotechnol 57: 467–473.
15. 15. Christiansen G, Fastner J, Erhard M, Börner T, Dittmann E (2003) Биосинтез микроцистина в планктотриксе: гены, эволюция и манипуляции.J Bact 185: 564–572.
16. 16. Кабош С., Пупен М., Леклер В., Фонтен А., Жак П. и др. (2008) NORINE: база данных нерибосомных пептидов. Nucleic Acids Res 36: 326–331.
17. 17. Дрейфус М., Хэрри Э., Хофманн Х., Кобель Х., Паче В. и др. (1976) Циклоспорин A и C: новые метаболиты Trichoderma polysporum. Microbiol 133: 125–133.
18. 18. von Wartburg A, Traber R (1988) Циклоспорины, метаболиты грибов с иммуносупрессивной активностью.Prog Med Chem 25: 1–33.
19. 19. McCormick MH, Stark WM, Pittenger GE, Pittenger RC, McGuire JM (1956) Ванкомицин, новый антибиотик. I. Химические и биологические свойства. Antibiot Annu 3: 606–611.
20. 20. Нагараджан Р. (1991) Антибактериальная активность и способы действия ванкомицина и родственных гликопептидов. Антимикробные агенты Chemother 35: 605–609.
21. 21. Рор Дж. (2006) Криптофициновые противоопухолевые препараты. ACS Chem Biol 1: 747–750.
22. 22. Wysocki VH, Resing KA, Zhang Q, Cheng G (2005) Масс-спектрометрия пептидов и белков. Методы 35: 211–222.
23. 23. Папаяннопулос И.А. (1995) Интерпретация тандемных масс-спектров пептидов при диссоциации, вызванной столкновением. Масс-спектрометр. Ред. 14: 49–73.
24. 24. Barlow CK, Hair RAJO (2008) Пептидная фрагментация в газовой фазе: как понимание основ дает трамплин для разработки новой химии и новых протеомных инструментов.J масс-спектрометр 43: 1301–1319.
25. 25. Harrison AG (2009) TO b OR NOT TO b: Продолжающаяся сага о пептидных b-ионах. Масс-спектрометр. Ред. 28: 640–654.
26. 26. Paizs B, Suhai S (2005) Пути фрагментации протонированных пептидов. Масс-спектрометр. Ред. 24: 508–548.
27. 27. Арнольд RJ, Jayasankar N, Aggarwal D, Tang H, Radivojac P (2006) Подход машинного обучения к прогнозированию спектров фрагментации пептидов. Pac Symp Biocomput 11: 219–230.
28. 28.Франк А.М. (2009) Прогнозирование рангов интенсивности ионов пептидных фрагментов. J Proteome Res 8: 2226–2240.
29. 29. Уэбб-Робертсон Б.-Дж., Кэннон В. Р. (2007) Современные тенденции в области вычислений на основе протеомики, основанной на масс-спектрометрии. Краткая биоинформатика 8: 304–317.
30. 30. Ли С., Арнольд Р.Дж., Танг Х., Радивояк П. (2011) О точности и пределах предсказания спектра фрагментации пептидов. Anal Chem 83: 790–796.
31. 31. Чжан З. (2004) Предсказание низкоэнергетических спектров диссоциации пептидов, вызванных столкновениями.Anal Chem 76: 3908–3922.
32. 32. UCSF Mass Spectrometry Facility, ProteinProspector. Доступно: http://prospector2.ucsf.edu/prospector/mshome.htm. (по состоянию на 15 сентября 2011 г.).
33. 33. Массело А (2006) InSilicoSpectro. Доступно: http://insilicospectro.vital-it.ch/. (по состоянию на 15 сентября 2011 г.).
34. 34. Колиндж Дж., Масселот А., Карбонелл П., Аппель Р. Д. (2006) InSilicoSpectro: библиотека протеомики с открытым исходным кодом. J Proteome Res 5: 619–624.
35. 35. Институт системной биологии (ISB), Proteomics Toolkit. Доступно: http://db.systemsbiology.net:8080/proteomicsToolkit/FragIonServlet.html. (по состоянию на 15 сентября 2011 г.).
36. 36. Li S (2010) PeptideART. Доступно: http://peptideart.sourceforge.net/. (по состоянию на 15 сентября 2011 г.).
37. 37. Strohalm M, Kavan D, Novák P, Volný M, Havlícek V (2010) mMass 3: кроссплатформенная программная среда для точного анализа масс-спектрометрических данных.Anal Chem 82: 4648–4651.
38. 38. Rusconi F (2009) massXpert 2: кроссплатформенная программная среда для моделирования химии полимеров и моделирования / анализа масс-спектрометрических данных. Биоинформатика 25: 2741–2742.
39. 39. Jagannath S, Sabareesh V (2007) Анализатор ионов пептидных фрагментов (PFIA): простой и универсальный инструмент для интерпретации тандемных масс-спектрометрических данных и de novo секвенирования пептидов. Масс-спектр Rapid Commun 21: 3033-3038.
40. 40.Лю В.Т., Нг Дж., Мелуцци Д., Бандейра Н., Гутьеррес М. и др. (2009) Интерпретация тандемных масс-спектров, полученных от циклических нерибосомных пептидов. Anal Chem 81: 4200–4209.
41. 41. Polfer NC, Oomens J, Suhai S, Paizs B (2005) Спектроскопические и теоретические доказательства образования оксазолонового кольца при диссоциации пептидов, вызванной столкновением. J Am Chem Soc 127: 17154–17155.
42. 42. Эккарт К. (1994) Масс-спектрометрия циклических пептидов. Масс-спектрометр. Ред. 13: 23–55.
43. 43. Накамура Т., Нахаки Х., Киношита Т. (1986) Определение аминокислотной последовательности циклических пептидов с помощью тандемной масс-спектрометрии в сочетании с ионизацией бомбардировкой быстрыми атомами. Mass Spectrosc 34: 307–319.
44. 44. Егоров А., Пайзс Б., Кузьма М., Забка М., Ланда З. и др. (2004) Экстрарибосомные циклические тетрадепсипептиды боверолиды: профилирование и моделирование путей фрагментации. J масс-спектрометр 39: 949–960.
45. 45. Шефер М., Фукс Р., Будзикевич Х., Спрингер А., Мейер Дж. М. и др.(2006) Выявление структуры циклических пиовердинов и изучение реакций перегруппировки в экспериментах МС / МС путем определения точных масс ионов продукта. J масс-спектрометр 41: 1162–1170.
46. 46. Kubwabo C, Vais N, Benoit FM (2005) Характеристика микроцистинов с использованием диссоциации, вызванной столкновением в источнике. Масс-спектр Rapid Commun. 19: 597–604.
47. 47. Юань М., Намикоши М., Оцуки А., Райнхарт К.Л., Сивонен К. и др. (1999) Низкоэнергетическое разложение активированным столкновением и структурная характеристика циклических гептапептидных микроцистинов с помощью масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением.J масс-спектрометр 34: 33–43.
48. 48. Mayumi T, Kato H, Kawasaki Y, Harada K-ichi (2007) Образование ионов диагностических продуктов из циклических пептидов цианобактерий по механизму деления с двумя связями с использованием жидкостной хроматографии с ионной ловушкой / многоступенчатой ​​масс-спектрометрии. Масс-спектр Rapid Commun 21: 1025-1033.
49. 49. Eckart K, Schwarz H, Tomer KB, Gross ML (1985) Методология тандемной масс-спектрометрии для определения последовательности циклических пептидов. J Am Chem Soc 107: 6765–6769.
50. 50. Ягуэ Дж., Парадела А., Рамос М., Огета С., Марина А. и др. (2003) Пептидная перегруппировка во время фрагментации квадрупольной ионной ловушки: добавление сложности к спектрам МС / МС. Anal Chem 75: 1524-1535.
51. 51. Harrison AG, Young AB, Bleiholder C, Suhai S, Paizs B (2006) Скремблирование информации о последовательности при диссоциации пептидов, вызванной столкновением. J Am Chem Soc 128: 10364–10365.
52. 52. Jia C, Qi W, He Z (2007) Реакция циклизации ионов пептидных фрагментов во время многоступенчатого коллизионного разложения: побуждение к потере внутренних аминокислотных остатков.J Am Soc Mass Spectrom 18: 663–678.
53. 53. Harrison AG (2008) Пептидная последовательность, скремблирующая посредством циклизации ионов b (5). J Am Soc Mass Spectrom 19: 1776-1780.
54. 54. Jia C, Qi W, He Z (2007) Реакция циклизации ионов пептидных фрагментов во время многоступенчатого коллизионного разложения: побуждение к потере внутренних аминокислотных остатков. J Am Soc Mass Spectrom 18: 663–678.
55. 55. Polfer NC, Oomens J, Suhai S, Paizs B (2007) Инфракрасная спектроскопия и теоретические исследования газофазного протонированного лей-энкефалина и его фрагментов: прямые экспериментальные доказательства для мобильного протона.J Am Chem Soc 129: 5887–5897.
56. 56. Bythell BJ, Maître P, Paizs B (2010) Реакции циклизации и перегруппировки ионов фрагмента a (n) протонированных пептидов. J Am Chem Soc 132: 14766–14779.
57. 57. Fuchs R, Budzikiewicz H (2001) Реакции перегруппировки в масс-спектрах ионизации электрораспылением пиовердинов. Int J Mass Spectrom 210–211: 603–612.
58. 58. Блейхолдер С., Осберн С., Уильямс Т.Д., Сухай С., Ван Стипдонк М. и др. (2008) Пути фрагментации протонированных пептидов со скремблированием последовательностей.J Am Chem Soc 130: 17774–17789.
59. 59. Tang XJ, Thibault P, Boyd RK (1993) Реакции фрагментации многократно протонированных пептидов и последствия для секвенирования с помощью тандемной масс-спектрометрии с диссоциацией, индуцированной столкновениями низкой энергии. Anal Chem 65: 2824–2834.
60. 60. Юань М., Намикоши М., Оцуки А. (1998) Влияние боковой цепи аминокислоты на фрагментацию циклических пептидных ионов: различия масс-спектров ионизации электрораспылением / индуцированного столкновением разложения токсичных гептапептидных микроцистинов, содержащих ADMAdda вместо Adda.Eur J Mass Spectrom 4: 287–298.
61. 61. Schilling B, Wang W, McMurray JS, Medzihradszky KF (1999) Фрагментация и секвенирование циклических пептидов с помощью матричной масс-спектрометрии с лазерной десорбцией / ионизацией после распада источника. Масс-спектр Rapid Commun 13: 2174–2179.
62. 62. Sabareesh V, Ranganayaki RS, Raghothama S, Bopanna MP, Balaram H, et al. (2007) Идентификация и характеристика библиотеки микрогетерогенных циклогексадепсипептидов из гриба Isaria.J Nat Prod 70: 715–729.
63. 63. Тилви С., Наик К.Г. (2007) Тандемная масс-спектрометрия кахалалидов: идентификация двух новых циклических депсипептидов, кахалалида R и S из Elysia grandifolia. J масс-спектрометр 42: 70–80.
64. 64. Томер К.Б., Кроу Ф.В., Гросс М.Л., Коппл К.Д. (1984) Бомбардировка быстрыми атомами в сочетании с тандемной масс-спектрометрией для определения циклических пептидов. Anal Chem 56: 880–886.
65. 65. Cooper HJ, Hudgins RR, Håkansson K, Marshall AG (2002) Характеристика потерь боковой цепи аминокислот при диссоциации с захватом электронов.J Am Soc Mass Spectrom 13: 241–249.
66. 66. Савицкий М.М., Нильсен М.Л., Зубарев Р.А. (2007) Потери боковой цепи при диссоциации захвата электронов для улучшения идентификации пептидов. Anal Chem 79: 2296–2302.
67. 67. Ся Кью, Ли М.В., Роуз С.М., Марш А.Дж., Хаблер С.Л. и др. (2011) Характеристика и диагностическая ценность нейтральных потерь боковой цепи аминокислот после диссоциации с переносом электрона. J Am Soc Mass Spectrom 22: 255–264.
68. 68. Leymarie N, Costello CE, O’Connor PB (2003) Диссоциация с захватом электронов инициирует каскад реакций свободных радикалов.J Am Chem Soc 125: 8949–8958.
69. 69. Lioe H, O’Hair RAJ (2007) Сравнение индуцированной столкновением диссоциации и индуцированной электронами диссоциации однократно протонированных ароматических аминокислот, цистина и родственных простых пептидов с использованием гибридного масс-спектрометра FT-ICR с линейной ионной ловушкой. Anal Bioanal Chem. 389: 1429–1437.
70. 70. Медзихрадски К.Ф. (2005) Анализ пептидной последовательности. Методы Enzymol 402: 209–244.
71. 71. Дери М.Дж., Саммерфилд С.Г., Бузи А., Дженнингс К.Р. (1997) Механизм потери 60 ед. Из пептидов, содержащих остаток аргинина на С-конце.J Am Soc Mass Spectrom 8: 253–261.
72. 72. Gehrig PM, Hunziker PE, Zahariev S, Pongor S (2004) Пути фрагментации N (G) -метилированных и немодифицированных остатков аргинина в пептидах, изученные с помощью ESI-MS / MS и MALDI-MS. J Am Soc Mass Spectrom 15: 142–149.
73. 73. Bythell BJ, Csonka IP, Suhai S, Barofsky DF, Paizs B (2010) Газофазная структура и пути фрагментации однократно протонированных пептидов с N-концевым аргинином. J Phys Chem B 114: 15092–15105 и цитируемые там ссылки.
74. 74. Swiderek KM, Davis MT, Lee TD (1998) Идентификация пептидных модификаций, полученных из белков, разделенных на гель, с использованием тройного квадруполя с электрораспылением и анализов с ионной ловушкой. Электрофорез 19: 989–997.
75. 75. Fang S, Takao T, Satomi Y, Mo W, Ahimonishi Y (2000) Новые перегруппированные ионы, наблюдаемые для протонированных пептидов посредством метастабильного разложения в времяпролетной масс-спектрометрии с лазерной десорбцией / ионизацией с помощью матрицы. J Am Soc Mass Spectrom 11: 345–351 и цитируемые там ссылки.
76. 76. Ngoka LCM, Gross ML (1999) Система номенклатуры для маркировки циклических пептидных фрагментов. Am Soc Mass Spectrom 10: 360–363.
77. 77. Биманн К. (1992) Масс-спектрометрия пептидов и белков. Анну Рев Биохим 61: 977–1010.
78. 78. Roepstorff P, Fohlman J (1984) Предложение по общей номенклатуре для последовательностей ионов в масс-спектрах пептидов. Биомасс-спектр 11: 601.
79. 79. Егоров А., Хавличек В. (2001) Спонтанный N -> O ацильный сдвиг в ионах [M + H] ⁺ [MeBmt1] -циклоспоринов в ионной ловушке.J масс-спектрометр 36: 633-640.
80. 80. Маюми Т., Като Х., Иманиши С., Кавасаки Ю., Хасегава М. и др. (2006) ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ Структурная характеристика микроцистинов с помощью ЖХ / МС / МС в условиях ионной ловушки. J Antibiot 59: 710–719.
81. 81. Намикоши М., Райнхарт К.Л., Сакаи Р., Стоттс Р.Р., Далем А.М. и др. (1992) Идентификация 12 гепатотоксинов из цветения озера Гомер цианобактерий Microcystis aeruginosa, Microcystis viridis и Microcystis wesenbergii: девять новых микроцистинов.J Org Chem 57: 866–872.

Сборка de novo бактериальных геномов с повторяющимися участками ДНК с помощью применения ДНК | BMC Bioinformatics

В этом разделе мы представляем основной конвейер обработки данных, который был реализован в новом ассемблере ДНК под названием ‘dnaasm’. Мы используем график де Брейна из-за его эффективности для данных секвенирования следующего поколения. В основном мы сосредоточены на описании процесса оценки длины тандемных повторов и процесса реконструкции повторяющихся фрагментов ДНК.Мы также представляем основные аспекты реализации, которые делают память нашего приложения и вычисления эффективными.

Рабочий процесс сборки

Построение и корректировка графа де Брейна

Первым этапом сборки de novo в ‘dnaasm’ является построение графа де Брейна. Как и в типичном сборщике ДНК de novo, dnaasm строит граф де Брейна из входного набора считываний ДНК, разделяя каждое считывание на набор k-мер. Каждый k-мер представляет собой подстроку длиной k из входного чтения ДНК — количество k-мер, сгенерированных из одного чтения ДНК длиной L , равно L — k +1.Затем к построенному графу де Брейна применяются некоторые алгоритмы исправления ошибок, аналогичные алгоритмам, реализованным ранее [7]. В частности, dnaasm использует алгоритмы для удаления кончиков, пузырей и краев небольшого веса. На этом этапе все ребра, представляющие ошибки секвенирования ДНК, должны быть удалены из графа де Брейна. Более того, ребра графа де Брёйна представляют собой подстроки длиной k , и в представленном подходе каждое ребро имеет дополнительное свойство, целое число, называемое весом ребра, которое отображает количество вхождений фрагмента ДНК длиной k в входной набор ДНК читает, как в графе А-Брейна [9].

Указанный вес ребра w равен точному количеству k-мер, где ребро представляет указанную подстроку ДНК длиной k в наборе чтений. Рассмотрим идеальный вход ассемблера R , называемый k-спектром, где чтения генерируются без ошибок из кольцевого бактериального генома последовательности s ₀ s ₁ … s _{G — 1} длины G и читает r ∈ R имеет одинаковую длину L , а R представляет собой набор всех подстрок s _i … s _{i + k −1} для 0≤ i ≤ G . Вес ребра w в этом случае равен \ (w = \ frac {N (L-k + 1)} {G} \) для неповторяющихся k-мер, где N обозначает количество чтений, а вес края \ (w = \ frac {\ Delta} {d} \ frac {N (L-k + 1)} {G} \), для k-мер внутри тандемного повтора длиной n , где повторяющийся мотив длина d повторяется ⌊ n / d ⌋ раз (целочисленное деление), тандемный повтор больше, чем размер графика, n > k , и Δ = n — k + 1.{x}}} {{x!}} \)), как показано в уравнении. 1.

$$ W \! \ Sim \! {Пуассон} ~ ({\ lambda}) ~ \ text {где} ~ \ lambda \, = \, \ frac {NL (L-k + 1) \ Delta} {Gkd}, \ Delta = n-k + 1 , $$

(1)

Оценка количества повторов

После построения и исправления графа де Брейна приложение dnaasm оценивает количество вхождений данного фрагмента ДНК, представленного ребром в графе де Брейна, в исследуемом геноме. {\ prime} = круглый (p * w) = \ lfloor p * w + 0.5 \ этаж $$

(3)

Правильная реконструкция повторяющейся последовательности требует высокого покрытия \ (c = \ frac {N * L} {G} \ ge 100 \). Когда c ≥10 Пуассоновское распределение веса ребра может быть аппроксимировано нормальным распределением \ (\ mathcal {N} (\ mu, \ sigma) \):

$$ W ‘\ sim \ mathcal {N} (\ mu, \ sigma) ~ \ text {where} ~ \ mu = \ frac {\ Delta} {d}, \ sigma = \ sqrt {\ frac {\ Дельта} {d}}, \ Delta = n-k + 1 $$

(4)

Для данного уровня достоверности q , 0≤ q ≤1 мы можем рассчитать необходимое покрытие для чтения c для правильной реконструкции повторяющихся мотивов, используя уравнение.{2} \ frac {\ Delta} {d} ~ \ text {where} ~ \ Delta = n-k + 1 $$

(5)

Процесс оценки количества вхождений данного фрагмента ДНК в исследуемый геном представлен на рис. 1.

Нормализация веса кромки. Пример эффекта нормализации веса кромки. a Ненормализованный граф — веса ребер отображают количество вхождений последовательности длины k в набор считываний. b Нормализованный график — веса ребер отображают количество вхождений фрагмента ДНК длиной k в исследуемом геноме

Обнаружение тандемных повторов

Следующим этапом процесса реконструкции тандемных повторов является обнаружение структур в графе де Брейна, которые представляют собой тандемные повторы в исследуемом геноме.Эти структуры выглядят как петли в графе де Брейна, связанные с остальной частью графа только одним внутренним и только одним внешним ребром. Другими словами, тандемные повторы представлены подграфом, где ровно одна вершина имеет два входящих и одно внешнее ребро, ровно одна вершина имеет одно внутреннее и два внешних ребра, а все остальные вершины имеют одно входное ребро. — кромка и одна кромка. Такая конструкция состоит из двух частей:

• ветвь от вершины, которая представляет вход в цикл, к вершине, которая представляет выход из цикла;

• ветвь от вершины, которая представляет выход из цикла, к вершине, которая представляет вход в цикл.

Пример структуры, представляющей тандемный повтор в графе де Брейна, представлен на рис. 2.

Обнаружение тандемных повторов. Примеры структур, представляющих и не представляющих тандемные повторы в графе де Брейна. граф Де Брейна с недопустимой структурой тандемных повторов — цикл в этом примере имеет две вершины с двумя внутренними ребрами и две вершины с двумя внешними ребрами. b Граф Де Брейна с допустимой структурой тандемных повторов — цикл в этом примере имеет одну вершину с двумя входящими ребрами и одну вершину с двумя внешними ребрами

Корректировка весов в тандемных повторах

Следующим этапом процесса реконструкции тандемных повторов является корректировка весов ребер в ранее обнаруженных циклах графа де Брейна.Во-первых, веса отдельных ветвей корректируются так, чтобы все веса веток имели одинаковый вес. Во-вторых, подсчитывается количество вершин в обеих частях петли. Затем веса ребер в менее многочисленных частях цикла адаптируются к весам ребер более многочисленных частей цикла, так что все вершины в цикле будут иметь 0 градусов. Здесь степень — это сумма весов ребер вершин, где веса входящих ребер положительны, а веса выходных ребер отрицательны.Пример корректировки нормированных весов ребер в петлях графа де Брейна представлен на рис.3.

Корректирующие веса в петлях графа де Брейна. Пример процесса корректировки весов в графе де Брейна. a Входной граф де Брейна. b Граф Де Брейна после корректировки весов в ветвях — вес ребра (GGT, GTA) был изменен на 2. Граф имеет нескорректированные веса в допустимых циклах — вершины ATT и TAA имеют степени, отличные от нуля. c График Де Брюйна после коррекции весов в допустимых циклах — веса менее многочисленной ветви (ATT, TTA, TAA) цикла были изменены таким образом, что все вершины цикла будут иметь нулевую степень

Разрешение тандемных повторов в последовательности ДНК

Последним этапом реконструкции повторяющейся последовательности ДНК из считываний секвенирования следующего поколения является создание последовательности ДНК из графа де Брейна. Этот процесс включает обход вершин графа де Брейна до тех пор, пока не встретится неоднозначная вершина.

Вершина считается однозначной, если она имеет ноль, одно или два входных (выходных) ребра и, в случае ровно двух входных (выходных) ребер, для одного из них существует простой путь возврата, т.е. путь от целевой вершины к исходной вершине, который имеет хотя бы одну вершину с более чем одним входным ребром и хотя бы одну вершину с более чем одним выходным ребром. Это условие делает количество неоднозначных вершин в нашем подходе меньше, чем в других существующих ассемблерах, где неоднозначность устанавливается, если вершина имеет более одного входного ребра или более одного выходного ребра.

Процесс разрешения тандемных повторов состоит из двух шагов: (1) поиск вершин без каких-либо входных ребер и по крайней мере с одним выходным ребром, такая вершина начинает новый контиг и становится текущей вершиной; (2) итеративная обработка непосредственно связанных вершин, т.е. добавление их к фактическим контигам и уменьшение веса посещенных ребер; если вес ребра равен 0, ребро удаляется из графа. Если текущая вершина v однозначна, она расширяет текущий контиг, в противном случае запускает новый.Более того, если текущая вершина v однозначна и имеет два выходных ребра, выбирается то ребро, для которого существует ранее определенный простой путь возврата.

Этот процесс повторяется до тех пор, пока не будут разрешены все неоднозначные вершины. Пример генерации последовательностей ДНК из графа де Брейна представлен на рис.4.

Создание последовательностей ДНК из графа де Брейна. Пример процесса построения выходных контигов из нормализованного графа де Брейна. Результирующий набор контигов должен содержать пять контигов: CCAT, CATGGGAG, CATTAACCC, TTTCCC и CCCGACGACGACT.Неоднозначные вершины (CAT и CCC) выделены серым цветом

Заключительные этапы сборки

Все ранее описанные этапы сборки de novo в приложении dnaasm приводят к генерации набора последовательностей ДНК, называемых unitigs. Затем созданные единицы можно расширить до контигов и каркасов с помощью парных конечных тегов и пар сопряжений — оба алгоритма также реализованы в приложении dnaasm.

Реализация

Веб-приложение было разработано в архитектуре клиент-сервер, где веб-браузер используется для связи с конечным пользователем, Python используется для реализации сервера приложений, а алгоритмы реализованы на C ++.Описанная архитектура основана на фреймворке bioweb [11], основные модули приложения представлены на рис. 5.

Модули приложения dnaasm. Основные модули приложения dnaasm. Приложение Dnaasm можно рассматривать как клиент-серверное приложение или программное обеспечение командной строки — приложение может запускаться с помощью графического пользовательского интерфейса или командной строки. Кроме того, версия для командной строки разработана в docker-контейнере, поэтому установка выполняется быстро и легко

Для достижения высокой производительности вычислительного модуля мы использовали несколько структур, эффективно использующих память, например.