Таблица строение амебы: Таблица по биологии (амебы и прочие твари) реферат по биологии

Распределенная база данных с открытым исходным кодом Решение Porxy

На основе этого могут быть достигнуты балансировщик нагрузки сервера, разделение на чтение и запись и высокая доступность. По сравнению с официальным прокси MySQL MySQL, автор подчеркивает удобство конфигурации амебы (файлы конфигурации на основе XML, которые легче писать правила с использованием синтаксиса SQLJEP, чем прокси MySQL на основе сценариев lua).
Amoeba эквивалентен маршрутизатору для запросов SQL. Он нацелен на обеспечение механизмов для балансировки нагрузки сервера, разделения чтения / записи и высокой доступности, а не на их полную реализацию. Вам необходимо использовать MySQL Replication и другие механизмы для реализации синхронизации реплик и других функций. Amoeba также использует подключаемый механизм для управления соединениями с базой данных и реализации маршрутизации. Третьи стороны могут разработать более продвинутые политики взамен авторской реализации.Эта программа в целом соответствует принципу KISS.

Что такое амеба?

Проект Amoeba, среда с открытым исходным кодом, запустил программное обеспечение Amoeba для Mysql в 2008 году. Это программное обеспечение предназначено для уровня прокси-сервера распределенной базы данных MySQL. Он действует как функция маршрутизации SQL при доступе к MySQL на уровне приложения и фокусируется на разработке уровня распределенного прокси-сервера базы данных. Он расположен между Клиентом и Сервером (ами) БД и прозрачен для Клиента.Обеспечивает балансировку нагрузки, высокую доступность, фильтрацию SQL, разделение на чтение и запись, маршрутизацию, связанную с целевой базой данных, и одновременные запросы для объединения результатов из нескольких баз данных. С Amoeba вы можете добиться высокой доступности, балансировки нагрузки и разделения данных из нескольких источников данных. В настоящее время амёба используется на производственных линиях многих предприятий. Основное решение:

• Уменьшите сложную структуру с несколькими базами данных, вызванную разделением данных


• Обеспечивает правила сегментирования и снижает влияние правил сегментирования данных на приложения


• Уменьшить количество соединений между базой данных и клиентом


• Разделение чтения / записи

Зачем нужен Амеба ?

С развитием традиционной технологии баз данных, быстрым развитием технологии компьютерных сетей и расширением области применения приложения баз данных получили широкое распространение в компьютерных сетях.В настоящее время централизованная система баз данных демонстрирует свои недостатки: централизованная обработка неизбежно приведет к снижению производительности. Сборка приложения запускается на компьютере. Как только компьютер выйдет из строя, это повлияет на всю систему, низкая надежность; централизованная обработка приводит к негибкому масштабированию и конфигурации системы, а также к плохой масштабируемости системы. В этой ситуации централизованная база данных будет развиваться в сторону распределенных баз данных. Прозрачная, простая конфигурация и многочисленные преимущества делают Amoeba отличным выбором среди прокси-серверов распределенных баз данных.

Принципы прокси распределенной базы данных

В области распределенных баз данных Amoeba стремится решать проблемы сегментирования данных и централизованно обрабатывать распределенные данные на клиентах. Централизация — понятие относительное. Клиенту не нужно знать физическое место хранения определенных данных. Этой логики можно избежать с точки зрения бизнеса, что значительно упростит клиентские операции с распределенными данными.Преимущества системы распределенных баз данных:

• Снижение затрат. Распределенные базы данных могут быть географически распределенными. Структура системы соответствует требованиям такого распределения. Пользователи могут использовать, запрашивать, поддерживать и выполнять локальное управление, чтобы снизить затраты на связь и избежать централизованных аппаратных устройств, требующих более высоких требований. Кроме того, распределенные базы данных содержат небольшой объем данных на одной машине, и их скорость отклика значительно увеличивается.


• Повышение общей доступности системы. Это позволяет избежать всех последствий паралича, вызванного отказом единственной базы данных.


• Простая масштабируемость и масштабируемость системы. Структура распределенной системы баз данных позволяет легко расширить систему. Новый узел добавляется в базу данных распределенных данных, не влияя на нормальную работу существующей системы. Этот метод более гибкий и экономичный, чем расширение централизованной системы. Расширение крупных систем и обновление системы в централизованных системах часто бывает дорогостоящим и невозможным из-за несовместимости оборудования и сложности изменения программного обеспечения.

Амеба Сопутствующие товары и их введение

1. Amoeba для MySQL

Amoeba для MySQL поддерживает уровень прокси-сервера распределенной базы данных MySQL. Он действует как функция маршрутизации запросов при доступе к MySQL на уровне приложения и фокусируется на разработке прокси распределенной базы данных. Он расположен между клиентом и сервером БД (прозрачен для клиента.Он имеет следующие функции: балансировка нагрузки, высокая доступность, фильтрация запросов, разделение на чтение и запись, связанный с маршрутизацией запрос к целевой базе данных и одновременные запросы для объединения результатов из нескольких баз данных. В Amoeba вы можете добиться высокой доступности, балансировки нагрузки и разделения данных для нескольких источников данных. В настоящее время он используется в производственных линиях многих предприятий. Amoeba для mysql — это виртуальный клиент mysql, который предоставляет протокол mysql. Клиент подключается к амебе так же, как к mysql.Вы должны настроить соответствующие атрибуты аутентификации в амебе.

2. Амеба для Аладдина

Подобно Amoeba для MySQL, протокол MySQL должен использоваться для подключения клиента к Aladdin. Протокол MySQL в основном используется для поддержки широкого спектра языков разработки mysql. Серверная часть Aladdin может одновременно подключаться к различным базам данных. Пока эти базы данных предоставляют драйверы jdbc. Появление aladdin может активно помочь предприятиям в интеграции баз данных.Пользователям не нужно знать, какие типы баз данных и физические адреса используются на сервере. aladdin анализирует операторы SQL и получает запрашиваемые таблицы и условия, затем эти правила объединяются с этими условиями для маршрутизации в соответствующую физическую базу данных.

3. Amoeba для MongoDB

С ростом популярности NoSQL mongoDB, как база данных nosql, получила широкое внимание благодаря своей выдающейся производительности.Можно сказать, что mongoDB заполняет пробелы между традиционными реляционными базами данных и традиционными базами данных «ключ-значение» и обладает обеими выдающимися характеристиками. Amoeba для MongoDB предоставляет полностью автономный и управляемый метод разделения, аналогичный Amoeba для MySQL, и пытается реализовать ту же функцию автоматического разделения. Основанный на платформе Amoeba, аналогично предыдущим продуктам, этот продукт предоставляет такие функции, как обнаружение пульса, балансировщик нагрузки на сервер, переключение при отказе и агрегацию запросов, а также сохраняет предыдущие методы настройки, если вы знакомы с настройкой одного из продуктов Amoeba продукты, начать работу очень просто.

Сравните Amoeba и похожие продукты

1. Сравнение Amoeba для Mysql и MySQL Proxy

В MySQL proxy 6.0, если вы хотите читать / писать, разделяя и читая кластеры и часто записывая кластерные машины, использование mysql proxy требует значительного объема работы. В настоящее время прокси-сервер mysql не имеет готового lua-скрипта. Прокси-сервер Mysql вообще не имеет файла конфигурации, и скрипт lua полностью об этом.Конечно, lua довольно удобен. Следовательно, для выполнения сложной конфигурации требуется большое количество скриптов. Amoeba для Mysql нужно только настроить в соответствии с требованиями.

2. Сравнение Amoeba для mongoDB и mongos

Разделение данных в mongodb имеет понятие чанка. Каждый фрагмент представляет собой сегмент данных (диапазон). Когда размер блока достигает указанного размера данных, он автоматически разделяется на две части.Mongos разделяется на основе сегмента данных (чанка), и поле, основанное на разбиении, должно быть ключом. В настоящее время в большинстве приложений IDS (особенно идентификаторы пользователей) являются последовательными, а у некоторых пользователей могут быть номера мобильных телефонов или номера членских карт. Это затрудняет реализацию разделения диапазона прокси. Следовательно, хотя mongodb mongos предоставляет функцию автоматического сегментирования, разделение данных не поддается контролю и часто не может удовлетворить наши потребности. Amoeba для MongoDB предоставляет полностью автономный и управляемый метод разделения.

Амеба Что я не могу сделать?

• В настоящее время транзакции не поддерживаются.


• Хранимые процедуры в настоящее время не поддерживаются (будут поддерживаться в ближайшем будущем)


• Не подходит для экспорта данных из амебы или запроса больших объемов данных (например, когда запрос возвращает более миллиона записей данных)


• В настоящее время сегментирование базы данных / таблицы не поддерживается.В настоящее время амеба поддерживает только экземпляры Database Sharding. Каждый разделенный узел должен поддерживать одну и ту же структуру таблицы базы данных.

Амеба Архитектура

Amoeba — это среда разработки DataBase Proxy. Он предназначен для решения проблемы разделения данных и разделения чтения / записи. Ниже описывается структура Amoeba.

• На основе Java NIO
  
  
  
  • Структура NIO использует неблокирующий режим.В отличие от традиционного программирования Socket, оно тратит впустую системные ресурсы и плохо масштабируется в случае большого количества одновременных запросов.


• Многоразовое подключение к серверу
  
  
  
  • Amoeba обеспечивает высокую доступность подключения к базе данных. В системе Amoeba все подключения к базе данных совместно используются всеми клиентами, подключенными к Amoeba одновременно.


• Разделение чтения / записи и разделение данных
  
  
  
  • Традиционная технология разделения чтения / записи может быть решена только с помощью клиента или соответствующей технологии драйвера базы данных, и конфигурация клиента также сложна.
  
  
  • Производительность отдельной базы данных всегда ограничена. На основе Amoeba вы можете найти линейно масштабируемую поддержку нескольких данных. Amoeba предоставляет администраторам баз данных удобное правило сегментирования данных, аналогичное синтаксису SQL.
    В то же время клиенту не нужно беспокоиться о том, что слишком много серверов базы данных привнесут дополнительные настройки в приложение.


• Поддерживает высокую доступность и баланс.
  
  
  
  • Amoeba обеспечивает обнаружение исключений подключения к базе данных и восстановление подключения.
  
  
  • Пользователи могут сэкономить на использовании других дорогостоящих аппаратных устройств балансировки нагрузки сервера. Amoeba предоставляет несколько политик балансировки нагрузки сервера баз данных (циклический перебор, количество активных подключений).


• Последовательность амеб

Таинственный 80-нм вирус амебы с почти полным «геномом ORFan» бросает вызов классификации ДНК-вирусов

Abstract

Здесь мы сообщаем об открытии Yaravirus, новой линии амебного вируса с загадочным происхождением и филогенезом.Яравирус представляет собой частицы размером 80 нм и геном дцДНК размером 44 924 п.н., кодирующий 74 предсказанных белка. Более 90% (68) предсказанных генов Yaravirus никогда ранее не описывались и представляют собой ORF. Только шесть генов имели отдаленные гомологи в общедоступных базах данных: экзонуклеаза / рекомбиназа, упаковывающая АТФаза, бифункциональная ДНК-примаза / полимераза и три гипотетических белка. Кроме того, нам не удалось получить вирусные геномы, тесно связанные с Yaravirus, в 8 535 общедоступных метагеномах, охватывающих различные среды обитания по всему миру.Геном Yaravirus также содержал шесть типов тРНК, которые не соответствовали обычно используемым кодонам. Протеомика показала, что частицы Yaravirus содержат 26 вирусных белков, один из которых потенциально представляет собой новый капсидный белок, не имеющий значительной гомологии с основными капсидными белками NCLDV, но с предполагаемым доменом двойного желеобразного валика. Yaravirus расширяет наши знания о разнообразии ДНК-вирусов. Филогенетическая дистанция между Yaravirus и всеми другими вирусами подчеркивает нашу все еще предварительную оценку геномного разнообразия эукариотических вирусов, усиливая необходимость выделения новых вирусов простейших.

Заявление о значимости Было замечено, что у большинства известных вирусов амебы есть много общих черт, которые в конечном итоге побудили авторов классифицировать их в общие эволюционные группы. Здесь мы описываем Yaravirus, сущность, которая может представлять либо первый изолированный вирус Acanthamoeba spp. вне группы NCLDV или, в альтернативном эволюционном сценарии, это удаленный и чрезвычайно редуцированный вирус этой группы. В отличие от других изолированных вирусов амебы, Yaravirus не представлен большой / гигантской частицей и сложным геномом, но в то же время несет большое количество ранее не описанных генов, включая один, кодирующий новый главный белок капсида.Метагеномные подходы также свидетельствовали о редкости Yaravirus в окружающей среде.

Введение

Эволюция и классификация вирусов были предметом интенсивных дискуссий, особенно после открытия гигантских вирусов, заражающих простейших (1–4). Эти вирусы преимущественно характеризуются большим размером вирионов и геномов, кодирующих от сотен до тысяч белков, большая часть которых в настоящее время остается без гомологов в общедоступных базах данных последовательностей (5–9).Эти кодирующие последовательности обычно называют ORFans, и из-за отсутствия филогенетической информации их происхождение и функция все еще остаются загадкой (10–13). Поразительно, но растущее число доступных вирусных геномов демонстрирует наличие огромного набора и большого разнообразия генов без гомологов в текущих базах данных, которые требуют дальнейшего изучения (10). Важно отметить, что многие гены ORFan амебного вируса уже доказали свою функциональность, они экспрессируются и кодируют компоненты вирусных частиц (6, 14).Однако большой набор ORFans затрудняет прогнозирование биологии вирусов, обнаруженных с помощью методов, не зависящих от культивирования, таких как метагеномный анализ, что усиливает необходимость дополнительной изоляции и экспериментальной характеристики новых вирусов.

Все известные в настоящее время изолированные вирусы амеб относятся к нуклеоцитоплазматическим вирусам большой ДНК (NCLDV) (15). В эту группу входят семейства эукариотических вирусов ( Poxviridae, Asfarviridae, Iridoviridae, Ascoviridae, Phycodnaviridae, Marseilleviridae и Mimiviridae ), а также другие линии амебальных вирусов, вирусы мимивирусов, вирусы микозавирусов, вирусы микозовирусов, вирусы микозовирусов, вирусы микозовирусов, пустовирусыNCDLV имеют геномы дцДНК и, как было предложено, имеют общее монофилетическое происхождение на основании критериев, которые включают совместное использование набора предковых вертикально наследуемых генов (16, 17). Из этого небольшого набора генов было обнаружено, что ключевой кластер генов присутствует почти во всех членах NCLDV и состоит из пяти отдельных генов, а именно из семейства ДНК-полимеразы B, прайма-геликазы, упаковывающей АТФазы, фактора транскрипции. и главный белок капсида (MCP), для которого двойная складка желе-ролла (DJR) составляет основной архитектурный класс белков (18, 19).Недавно Международный комитет по таксономии вирусов (ICTV) выдвинул предложение о мегатаксономии вирусов. Супермодуль главного капсидного белка DJR (MCP) ДНК-вирусов присутствует в NCLDV и других икосаэдрических вирусах, которые инфицируют прокариот и эукариот. В дополнение к сигнатуре DJR-MCP, большинство этих вирусов также кодируют дополнительные минорные белки капсида (например, белки пентона) и АТФазы, упаковывающие геном, суперсемейства FtsK-HerA. Согласно этому предложению, эволюционная консервация трех генов морфогенетического модуля в супермодуле DJR-MCP, за исключением всех других вирусов, оправдывает создание области под названием Dividnaviria .Хотя некоторые NCLDV, такие как pandoraviruses, по-видимому, утратили ген DJR-MCP, в их геноме присутствует большой набор генов, которые подтверждают их классификацию в NCLDV (и, следовательно, Dividnaviria ).

Здесь мы описываем открытие Yaravirus, вируса амебы с загадочным происхождением и филогенезом. Яравирус не содержит всех трех отличительных генов Dividnaviria , в которых отсутствует идентифицируемая последовательность минорного капсидного белка с одним желеобразным валиком. Кроме того, у Yaravirus есть загадочный геном, почти полный набор генов которого — ORFans.Яравирус может представлять собой первый выделенный вирус из Acanthamoeba spp. вне группы NCLDV. Этот вирус имеет частицы с каноническим размером 80 нм, что выходит за рамки концепции больших и гигантских вирусов. Таким образом, Yaravirus расширяет наши знания о вирусном разнообразии и бросает вызов существующей классификации ДНК-вирусов.

Результаты

Цикл выделения и репликации яравируса

Поисковое исследование было проведено путем сбора образцов мутной воды из ручьев искусственного городского озера под названием Пампулья, расположенного в городе Белу-Оризонти, Бразилия.Здесь, используя протокол прямого посева образцов воды на культуры Acanthamoeba castellanii (штамм Neff, ATCC 30010), нам удалось выделить новый амебный вирус, который мы назвали Yaravirus brasiliensis, как дань уважения важному персонажу ( Яра, мать вод) мифологических историй коренных племен тупи-гуарани (20). Отрицательное окрашивание выявило присутствие мелких икосаэдрических частиц в супернатанте инфицированных амебных клеток диаметром около 80 нм (рис.1а). Изображения очищенных частиц с помощью криоэлектронной микроскопии позволяют предположить, что частицы Yaravirus представляют собой две оболочки капсида, как ранее описано для Faustovirus (21).

Частица яравируса и начало вирусного цикла. a Отрицательное окрашивание изолированного вириона Yaravirus. Шкала шкалы 100нм. b Просвечивающая электронная микроскопия (ТЕМ), представляющая начало вирусного цикла, в котором одна частица связана с мембраной клетки-хозяина, а вторая уже была включена амебой внутри эндоцитарной везикулы.Шкала шкалы 200нм. c Детальное изображение внедренной частицы яравируса внутри эндоцитарной везикулы. Шкала шкалы 100нм. d Поглощение вируса амебой может происходить индивидуально, но также и группами частиц, как видно на микрофотографии. Шкала шкалы 250 нм. e Вирусная фабрика полностью развивается, занимая ядерную область и рекрутируя митохондрии вокруг нее. Могут быть различимы две разные области: электронно-просветная область, где вирионы собраны в виде пустых оболочек, и вторая область, образованная несколькими электронно-плотными точками, где геном упакован внутри частиц.Шкала шкалы 500 нм.

В начале заражения у A. castellanii частицы яравируса обнаруживаются прикрепленными к внешней части плазматической мембраны амеб, что свидетельствует об участии рецептора хозяина в интернализации вирионов (рис. 1b). Затем цикл репликации сопровождается включением отдельных или сгруппированных частиц Yaravirus внутрь эндоцитарных пузырьков, которые на более поздней стадии инфекции обнаруживаются рядом с областью, занятой ядром (рис.1б-г). Затем происходит вирусная фабрика, которая полностью превращается в свою зрелую форму, заменяя область, ранее занимаемую ядром клетки, и рекрутируя митохондрии вокруг его границ, что, вероятно, оптимизирует доступность энергии для создания вирионов (рис. 1e). Этап, соответствующий вирусному морфогенезу, происходит аналогично тому, как он наблюдается для других вирусов амебы. Во-первых, он начинается с появления небольших полумесяцев в электронно-просветной области фабрики (рис.1д, рис. 2а). Затем шаг за шагом вирионы приобретают икосаэдрическую симметрию путем последовательного добавления более одного слоя белка или мембранных компонентов вокруг своей структуры (рис. 2а). Сконструированные вирионы с пустым капсидом затем начинают мигрировать к периферии вирусной фабрики, где происходит накопление корпускулярного электронно-плотного материала (рис. 1e, рис. 2b-c). Эти энуклеации разбросаны по периферии инфицированной клетки и, по-видимому, представляют различные области или точки морфогенеза, где происходит заключительный этап созревания Yaravirus.В этих областях капсид Yaravirus заполнен электронно-плотным материалом, и вирус, наконец, готов к высвобождению (рис. 2c — красная стрелка). Иногда также можно наблюдать несколько частиц Yaravirus, упакованных внутри везикулоподобных структур, что указывает на возможное высвобождение путем экзоцитоза, как это наблюдается для других вирусов амеб (22, 23) (рис. 2d). Однако большая часть выделения вируса по-прежнему представлена ​​лизисом амебной клетки с последующим высвобождением частиц яравируса, которые позже достигают супернатанта инфицированной культуры или иногда могут прикрепляться к остаткам клеточных мембран (рис. .2д). Мы также оценили репликацию Yaravirus, одновременно исследуя уменьшение количества клеток-хозяев, связанных с увеличением вирусного генома во время инфекции. Интересно, что в течение первых часов заражения культуры A. castellanii , по-видимому, прогрессивно растут до 24 часов в день, демонстрируя строгий характер репликации вируса Yaravirus (рис. 2f). Затем клетки начинают подвергаться лизису, индуцированному вирусом, только после 72 часов в секунду (рис. 2f). На том же уровне с 96 ч.p.i до 7 дней после заражения не наблюдается изменений в уровнях обнаружения генома Yaravirus, и лизис, кажется, прекращается, а оставшиеся трофозоиты превращаются в цисты (данные не показаны).

Yaravirus. a Вирионы собираются путем добавления более одного слоя белка или мембранных компонентов вокруг его структуры. Шкала шкалы 70нм. b Затем частицы начинают мигрировать к периферии клетки, где есть несколько электронно-плотных точек, которые функционируют как морфогенетические структуры для упаковки ДНК внутри частиц яравируса (области внутри пунктирных линий).Шкала шкалы 1000нм. c Подробное изображение морфогенетических областей, где ДНК (красная стрелка) встроена в вирион Yaravirus (черная стрелка). Шкала шкалы 150 нм. d Иногда на заключительном этапе репликации вируса частицы упаковываются внутри везикулоподобных структур, что указывает на возможное высвобождение за счет экзоцитоза. Шкала шкалы 500 нм. e Однако большая часть частиц высвобождается в результате клеточного лизиса и имеет высокое сродство к мембранам клеточного мусора.Шкала шкалы 150 нм. f График, сравнивающий одновременное уменьшение количества клеток-хозяев (красные столбцы) с увеличением генома яравируса во время инфекции (черная линия). Репликацию вирусного генома измеряли с помощью qPCR и рассчитывали с помощью дельта-дельта Ct.

Геном

Секвенирование генома Yaravirus показало наличие двухцепочечной молекулы ДНК длиной 44 924 п.н., несущей в общей сложности 74 предсказанных гена (рис. 3a). Несмотря на меньший геном, чем у других вирусов амебы, Yaravirus кодирует шесть генов тРНК: тРНК-Ser (gct), тРНК-Ser (tga), тРНК-Cys (gca), тРНК-Asn (gtt), тРНК-His (gtg ) и тРНК-Ile (aat) (рис.3а и в). Все они расположены в межгенной области между генами 29 и 30 (рис. 3a и c). В отличие от генов тРНК в тупанвирусах, мы не наблюдали корреляции между изоакцепторами тРНК Yaravirus и кодонами, наиболее часто используемыми вирусом или его хозяином A. castellanii . Геном имеет содержание GC 57,9%, что является одним из самых высоких показателей среди всех обнаруженных на сегодняшний день амебных вирусов. При генетическом анализе Yaravirus имеет спектр содержания GC, который варьируется от 46% до 65%.Анализ межгенных участков генома (содержание GC 46%) не выявил никаких мотивов обогащенной последовательности, которые могли бы указывать на консервативный промотор, в отличие от того, что наблюдается у многих других членов NCLDV (24).

Yaravirus. a Круговое представление генома Yaravirus с выделением только шести генов (красные стрелки), которые имеют сходство с аминокислотными последовательностями других организмов в текущих базах данных. Гены, для которых нет совпадений в базах данных, показаны зелеными стрелками. b Процент генов ORFan среди полного генома различных вирусов амебы представлен графиком с красными шкалами. График с зеленоватыми шкалами представляет собой абсолютное количество генов с гомологами в базах данных (гены без ORFan) для каждого из тех же амебных вирусов, проанализированных ранее. c Все шесть предсказанных Yaravirus тРНК, а также их соответствующие последовательности изображены с информацией об их антикодоне (в скобках), длине их нуклеотидов,% содержания GC и положении в межгенных областях генов 29 и 30. .

Если рассматривать только части генома, относящиеся к кодирующим областям, Yaravirus также имеет такую ​​же кодирующую способность, что и другие вирусы, когда их геном был впервые аннотирован, примерно 90%.

Удивительно, но аннотация генома Yaravirus показала, что ни один из его генов не соответствует последовательностям известных организмов, когда мы сравнивали их на уровне нуклеотидов. Когда мы искали гомологию на аминокислотных уровнях, мы обнаружили, что только два предсказанных белка имели совпадения в базе данных Pfam-A, а в общей сложности шесть имели отдаленные совпадения в базе данных nr.Дополнительное предсказание трехмерных структур этих белков указывало на потенциальную функцию еще 4 генов (см. Анализ протеомики). Взятые вместе, более 90% (68) предсказанных генов Yaravirus являются ORFans, чего не наблюдалось для амебных вирусов с момента открытия пандоровирусов (даже после использования более мягких критериев, BLASTp, e-value <10 ⁻³ ) (Рис. 3б) (25). Шесть генов, продукт которых имеет некоторую гомологию с известными белковыми последовательностями (рис. 3b) (таблица 1), гомологичны фрагментам белков, которые, как предполагается, имеют разные функции, таким как бактериальный белок экзонуклеаза / рекомбиназа (ген 2; наилучший результат: Timonella senegalensis ), гипотетический белок (ген 3; лучший результат: A.castellanii ), гипотетический белок (ген 28; лучший результат: Acytostelium subglobosum LB1 — диктиостелид), упаковывающая АТФаза (ген 40; лучший результат: эндемический вирус Pleurochrysis), консервативный гипотетический белок (ген 46; лучший результат: Мельбурневирус, штамм марсельлевируса) и бифункциональная ДНК-примаза / полимераза (ген 69; лучший результат: Marinobacter sp — протеобактерии Alpha ) (Таблица 1).

Гены Yaravirus, сходные с текущими базами данных, и их лучшие результаты

Затем был проведен филогенетический анализ этих различных генов (гены 02, 03, 28, 40, 46 и 69) после их сопоставления с последовательностями белков схожей функции принадлежат к разным членам виросферы и организмам трех клеточных сфер жизни.Учитывая отсутствие представителей в уже известных базах данных, помимо их лучших совпадений, последовательности, соответствующие генам 03 и 28 (оба гипотетических белка), не обладали достаточной генетической информацией для включения в филогенетический анализ. Для анализа, соответствующего гену 02 (экзонуклеаза / рекомбиназа), наблюдали три основные группы для построения морфологии дерева. Яравирус был помещен в одну из этих ветвей, сгруппировавшись с некоторыми членами Eukarya, особенно с каменными кораллами и насекомыми (рис.4). Анализ гена 40 (АТФаза, упаковывающая вирион) показал, что Yaravirus сгруппирован в полифилетическую ветвь с членами, принадлежащими к семейству Mimiviridae , бактериями (хотя многие из этих последовательностей, по-видимому, представляют собой неправильно классифицированные NCLDV из геномов, собранных метагеномом) и Pleurochrysis sp. эндемический вирус 1a и 2. Для филогенетических анализов, соответствующих гену 46 (гипотетический белок, законсервированный в Marseillevirus), Yaravirus был объединен со штаммами Marseillevirus. Для последнего дерева, представляющего анализ на ген 69 (бифункциональная ДНК-примаза / полимераза), мы наблюдали, что Yaravirus разделяет кластер с членами эукариот, соответствующих группам Streblomastix и Phytophthora.Однако следует отметить, что в предыдущем исследовании авторы обнаружили последовательности генов мимивирусов в геноме паразитарного штамма Phytophthora INRA-310 (26). После всех этих анализов важно отметить, что, хотя у Yaravirus есть некоторые гены с представителями в геноме других организмов, их гомология с ортологами очень низкая (от 25,24 до 44,12%), что подчеркивает, что содержание генома Yaravirus существенно отличается от других. члены виросферы (таблица 1).

Филогенетическое дерево гена Yaravirus, соответствующего вероятной экзонуклеазе / рекомбиназе, представлено в наиболее удачном фрагменте Timonella senegalensis .Также представлены похожие гены, включенные в геном бактерий (зеленый), эукарион (розовый) и других вирусов (синий).

Для обнаружения последовательностей, связанных с Yaravirus, мы исследовали 8 535 общедоступных метагеномов в базе данных IMG / M, которые были созданы из образцов из различных мест обитания по всей нашей планете (27). Мы обнаружили отдаленные гомологи АТФазы Yaravirus (NCVOG0249) с аминокислотной гомологией до 33,9% в метагеномных данных, в то время как ближайшим гомологом в базе данных NCBI nr был гомолог Pleurochrysis sp.эндемический вирус 1a — 33,1%. В филогенетическом дереве вирусной АТФазы Yaravirus разветвился в пределах Mimiviridae как часть высоко поддерживаемой клады, состоящей из его дальних метагеномных родственников и трех вирусов, геномы которых были депонированы в NCBI Genbank и названы Pleurochrysis sp. эндемический вирус 1a, 1b и 2 (рис. 5). В отличие от известных представителей Mimiviridae , вирусные контиги и вирусные геномы в этой кладе имели высокое содержание GC до 62%. Мы также искали белки, подобные предполагаемому MCP Yaravirus, но не смогли найти близкородственные последовательности в метагеномных данных.

Филогенетическое положение Yaravirus и связанных вирусных последовательностей в Mimiviridae на основе вирусной АТФазы (NCVOG0249). АТФаза Yaravirus выделена желтым цветом. Поддержка ветви обозначена цветными кружками для значений поддержки 90 или ниже. Дерево уходит корнями в поксвирусы. Масштабная полоса указывает замены для каждого сайта. Содержание GC вирусных геномов и контигов, содержащих NCVOG0249, показано вместе со средним содержанием GC свернувшихся клад. Кроме того, показано экологическое происхождение и размеры сборки Yaravirus и связанных вирусных контигов и геномов.Номера доступа (IMG / M) (REF) метагеномных последовательностей указаны в виде цифр перед первым тире в названии последовательности.

Протеомика вируса Yaravirus

Как упоминалось выше, у большинства белков Yaravirus не было обнаруживаемых гомологов в общедоступных базах данных, и, с первой точки зрения, вирус не кодировал белки капсида. Эта особенность побудила нас поближе взглянуть на белки, ответственные за формирование зрелых частиц яравируса. Протеомика выявила в общей сложности 26 вирусных белков, присутствующих в очищенных частицах.Затем мы проанализировали предсказанные трехмерные структуры этих 26 белков, используя две платформы для сравнения доменов, Phyre2 и инструменты Swiss-model (28–33). Примечательно, что только 4 последовательности (гены 11, 12, 41 и 46) имели структурные особенности, сходные с известными белками (таблица 2). Это означает, что почти 90% протеома вириона состоит из ORF. Важно отметить, что тот же подход (предсказание структуры in silico) использовался параллельно для оценки всех 74 предсказанных генов в геноме Yaravirus, что привело к открытию еще двух генов со структурным сходством с другими общедоступными белками. базы данных (ген 02 и 70) (таблица 2).

Аннотация белков Yaravirus, основанная на предсказанной трехмерной структуре белков, кодируемых вирусом.

Данные протеомики показали, что наиболее распространенные белки в вирусных частицах соответствуют генам 41, 46 и 51 (от наибольшего к менее массовому) (Таблица 2). В то время как для третьего по величине экспрессируемого белка мы не смогли найти никаких структурных кандидатов с известной биологической функцией, для последовательностей, представленных генами 41 и 46, мы наблюдали фрагменты белка, напоминающие трехмерную структуру капсида других вирусов (Таблица 2 ).С достоверностью 97% было обнаружено, что соответствующая часть (65%) гена 41 имеет структурную конвергенцию с доменом двойного желеобразного валика MCP вируса Paramecium bursaria Chlorella типа 1. Ген 46, кодируемый предсказанным белком, был Обнаружено, что они имеют структурную конвергенцию с бактериальным секретируемым белком pcsB и белком хвостовой иглы, частью, состоящей из длинной альфа-спирали. Функции белка, кодируемого геном 46, еще предстоит исследовать. Следовательно, нам не удалось убедительно найти какой-либо минорный белок капсида.Также важно отметить, что последовательности, представленные геном 46, идентичны описанным ранее, чтобы быть высококонсервативными (хотя и с неизвестной функцией) в марсельлевирусах и медусавирусах (таблица 1). Наконец, последние два белка, наблюдаемые в протеомике, которые имеют структурные отложения в общедоступных базах данных, представлены генами 11 и 12, оба экспрессируют предсказанные C1-q-подобные белки комплемента.

Обсуждение

В последние годы амебные большие и гигантские вирусы часто обнаруживались по всему миру (5–9, 20, 22, 25, 34–37).Здесь мы описываем Yaravirus brasiliensis, вирус размером 80 нм с геномом, содержащим значительную долю генов (~ 90%), которые ранее никогда не наблюдались. Используя стандартные протоколы, наш самый первый генетический анализ не смог найти какие-либо узнаваемые последовательности капсида или других классических вирусных генов в Yaravirus. Это актуальная особенность, чтобы подчеркнуть важность исследований, связанных с выделением новых вирусных образцов, поскольку, следуя текущим метагеномным протоколам для обнаружения вирусов, яравирус даже не будет распознаваться как вирусный агент (38, 39).По нашим данным, Yaravirus представляет собой первый вирус, выделенный из Acanthamoeba spp. это потенциально не является частью сложной группы NCLDV. Ранее открытые амебные вирусы объединяют несколько характеристик: вирионы большого размера, геномы, кодирующие от сотен до тысяч генов, и предположительно монофилетическое происхождение, что отражается в наличии набора из примерно 20 наиболее вероятных вертикально наследуемых генов (16, 17). Ни одна из этих особенностей не присутствует в Yaravirus, и это делает его потенциально первым изолятом новой группы bona fide амебного вируса.Конечно, мы не можем исключить возможность того, что Yaravirus может представлять собой уменьшенный NCLDV, представляющий сильно дивергентные или даже отсутствующие отличительные белки NCLDV. Недавно подобный случай был описан для трех небольших вирусов ракообразных. Однако, несмотря на их уменьшенный геном по сравнению с другими членами NCLDV, важное количество отличительных генов было общим с этой группой, в отличие от Yaravirus (40). В этом, не менее захватывающем сценарии, Yaravirus будет представлять на сегодняшний день самый маленький член NCLDV как по размеру частиц, так и по размеру генома.Присутствие шести копий тРНК в Yaravirus также впечатляет при анализе с точки зрения избирательного давления, вынуждающего поддерживать эти гены в таком маленьком геноме, по сравнению с более крупными вирусами амеб. Еще более интересно то, что ни один из изоакцепторов, связанных с тРНК Yaravirus, не соответствует кодонам аминокислот, широко используемых вирусом или амебой. Учитывая сложный цикл заражения Yaravirus в Acanthamoeba , можно предположить, что в природе другой организм может выступать в качестве предпочтительного хозяина Yaravirus.

Большинство представителей выделенных на сегодняшний день гигантских вирусов амебы демонстрируют капсид, специально составленный из копий MCP, родственных D13L вируса осповакцины (14, 41). Пандоравирусы являются исключением, поскольку у них, по-видимому, отсутствует белковая оболочка для защиты своих геномов (25). Интересно, что даже некоторые из амеб-хозяев этих вирусов могут нести копии генов MCP, что указывает на возможный горизонтальный перенос генов между вирусом и протистом-хозяином (42, 43). Несмотря на то, что капсид Yaravirus, кажется, не гомологичен NCLDV MCP, один из его наиболее распространенных белков имеет тот же архитектурный двойной желеобразный валик, который наблюдается в MCP гигантских вирусов.Это подчеркивает, как белки с полностью неописанными последовательностями могут быть сформированы эволюционной конвергенцией для выполнения важных биологических функций (44). В совокупности мы можем заключить, что Yaravirus представляет собой новую линию вирусов, выделенных из клеток A. castellanii . Количество неизвестных белков, составляющих частицы яравируса, отражает изменчивость, существующую в вирусном мире, и то, какой потенциал новых вирусных геномов еще предстоит открыть.

Методы

Происхождение образцов и выделение вируса

В 2017 году в целях выделения новых вариантов вирусных амеб мы собрали образцы мутной воды из ручья озера Пампулья, искусственной лагуны, расположенной в городе Белу-Оризонти, Бразилия (19 ° 51 0.60S и 43 ° 58 18,90 Вт). Как только они были собраны, образцы были быстро доставлены в нашу лабораторию и хранились при 4 ° C до дальнейшей обработки. Следуя протоколу, 4 × 10 ⁴ амеб штамма Acanthamoeba castellanii Neff (ATCC 30010) были засеяны в каждую лунку 96-луночного планшета, инокулируя в каждую из них объемом около 100 мкл собранных образцов, первоначально разбавлен 1:10 в буфере PBS. Затем планшеты инкубировали в течение 7 дней при 32 ° C и ежедневно наблюдали за появлением цитопатического эффекта, что может указывать на вероятную вирусную инфекцию.Затем все содержимое лунок было собрано и подверглось трем процессам замораживания и оттаивания и анализа возможных изолятов методом отрицательного окрашивания. К концу собранное содержимое было подвергнуто еще двум слепым пассажам в свежих культурах амеб, но на этот раз в 25 см. ² Колбы для обработанных культур клеток Nunc ™ с фильтрующими крышками (Thermo Fisher Scientific, США), содержащие около 1 миллиона амебные клетки. После выделения вируса были проведены все следующие эксперименты путем инфицирования клеток Acanthamoeba castellanii при низкой множественности инфекции (MOI) с учетом требовательного цикла репликации вируса Yaravirus.

Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ), ПЭМ-томография, криоэлектронная микроскопия

Для заливки смол и просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) Клетки Acanthamoeba castellanii , инфицированные Yaravirus, фиксировали через 20 часов после заражения 2,5% глютаральдегидом в 0,1 Какодилат натрия M буфер. Клетки промывали трижды раствором 0,2 М сахарозы в 0,1 М какодилате натрия. Клетки постфиксировали в течение 1 часа 1% OsO4, разведенным в 0,2 М гексацианоферрате калия (III) / 0.1M какодилат натрия. После промываний дистиллированной водой клетки постепенно обезвоживали этанолом в последовательных 10-минутных ваннах в 30, 50, 70, 96, 100 и 100% этаноле. Замена была достигнута путем последовательного помещения клеток в 25, 50 и 75% растворы Epon на 15 мин. Клетки помещали на 1 ч в 100% раствор Epon и в свежий 100% Epon на ночь при комнатной температуре. Полимеризация происходила с клетками в свежем 100% эпоне в течение 48 ч при 60 °. Ультратонкие срезы толщиной 70 или 300 нм вырезали на ультрамикротоме UC7 (Leica) и помещали на сетки HR25 300 Mesh Copper / Rhodium (TAAB, UK).Контрастирование ультратонких срезов проводили по Рейнольдсу (45). Электронные микрофотографии получали на ТЕМ Tecnai G ²⁰ , работающем при 200 кэВ, оборудованном камерой Eagle с разрешением 4096◻ × 4096 пикселей (FEI)). Для томографии наночастицы золота диаметром 10 нм (Ref. 741957; Sigma-Aldrich) были нанесены на обе стороны срезов перед контрастированием. Серия томографических изображений наклона была получена на G ²⁰ Cryo TEM (FEI) с программным обеспечением Explore 3D (FEI) для диапазонов наклона 110 ° с шагом 1 °.Средняя применяемая дефокусировка составляла -2 мкм. Увеличение варьировалось от 3500 до 29000 с размером пикселей от 3,13 до 0,37 нм соответственно. Размер изображения составил 4096 ² пикселей. Ряды наклона были выровнены с помощью ETomo из программного пакета IMOD (Университет Колорадо, США) методом взаимной корреляции (46). Томограммы были восстановлены с использованием алгоритма взвешенной обратной проекции в программе ETomo от IMOD. Средняя толщина полученных томограмм составила 268,40 ± 64 нм ( n = 16).Fiji / ImageJ (NIH, США) использовался для создания томографических фильмов (47).

Для анализов с помощью криоэлектронной микроскопии супернатант инфицированных культур Acanthamoeba castellanii собирали через 7 дней после заражения и подвергали первому циклу центрифугирования при 1500 g в течение 10 минут, чтобы осаждать остатки клеток из вирус присутствует в супернатанте. Затем часть, содержащую Yaravirus, затем подвергали второму раунду центрифугирования, и вирус концентрировали ультрацентрифугированием при 100.000г в течение 2ч. Следующие шаги были ранее описаны Клозе и др. (21). Вкратце, мкл вирусного раствора помещали на решетку C-Flat 2/2 с тлеющим разрядом (EMS) и погружали замороженными в жидкий этан с использованием Gatan Cryoplunge 3. Затем образцы визуализировали на Talos F200C (ThermoFisher Scientific), оборудованном Ceta. камера (ThermoFisher Scientific).

Последовательность генома и анализ

Геном Yaravirus секвенировали два раза с использованием платформы Illumina Miseq (Illumina Inc., Сан-Диего, Калифорния, США) с приложением парного конца. Затем сгенерированные чтения были собраны de novo с использованием программного обеспечения ABYSS и SPADES, с полученными контигами, упорядоченными программным обеспечением CONTIGuator.py на основе Python. После этого были сделаны прогнозы генов с помощью инструмента GeneMarkS (48). Функциональная аннотация для белков, предсказанных Yaravirus, была сделана путем поиска в базе данных неизбыточных последовательностей белков (nr) GenBank NCBI, с учетом гомологичных белков только последовательностей, которые имели значение е <1 × 10 ^-3 .Для анализов кПЦР увеличение репликации генома оценивалось в культурах клеток Acanthamoeba castellanii , инфицированных Yaravirus в различные моменты времени (h5, H6, H8, h22, h34, H72, H96 и h268), с использованием праймеров, которые были сконструированы. на основе последовательности гена 69 Yaravirus (праймеры: 5’TGCAGCAAGTCGGTCAAGAT3 ‘и 5’AACTTCCACATGCGAAACGC3’). Условия, используемые в анализе, были описаны ранее (49).

Данные об использовании аминокислот и кодонов сравнивали с данными, представленными Acanthamoeba castellanii и различными штаммами вирусов амеб.Для этого последовательности были загружены из базы данных NCBI и проанализированы с помощью программного обеспечения Artemis 18.0.3. Процент содержания ГХ и перекоса ГХ также были проанализированы с использованием того же программного обеспечения. Последовательности транспортной РНК (тРНК) идентифицировали с помощью инструмента ARAGORN.

Филогенетический анализ был проведен для шести белков Yaravirus, имеющих сходство с другими организмами в базе данных NCBI (Таблица 1). Используя инструмент Clustal W в программе Mega 10.0.5, аминокислотные последовательности этих белков Yaravirus были предварительно выровнены с соответствующими последовательностями представителей виросферы и других клеточных организмов, принадлежащих к трем доменам жизни.Все деревья были построены с использованием метода эволюции максимального правдоподобия с использованием модели на основе матрицы JTT и начальной загрузки 1000 повторов (50).

Протеомика вируса Yaravirus

Для идентификации белков, составляющих частицы Yaravirus, выделенным вирусом инфицировали тридцать колб для клеточных культур размером 75 см2 (Nunc, США), содержащих 7 × 10 ⁶ Acanthamoeba castellanii и цитопатический эффект прослеживался до 7 dpi После тяжелого амебного лизиса содержимое собирали и подвергали первому раунду центрифугирования при 1500 g в течение 10 мин с целью осаждения клеточного дебриса вируса, присутствующего в супернатанте.Затем эту вирусную часть подвергали второму раунду центрифугирования, и вирус концентрировали ультрацентрифугированием при 100000 g в течение 2 часов. Для завершения готовили осадок вируса для 2D-гель-электрофореза и анализа с помощью MALD-TOF и LC-MS / MS, как описано ранее Reteno и соавторами (51)

Метагеномный обзор

АТФаза Yaravirus (NCVOG0249) и предполагаемый Major Capsid Protein (MCP) использовался для запроса 8 535 общедоступных метагеномов в базе данных IMG / M (27) с помощью diamond blastp (v0.9.25.126, (52)). Полученные совпадения белков с охватом более 30% запросов и субъектов и значением E не менее 1e-5 были извлечены из метагеномных данных. Параллельно с этим был использован hmmsearch (версия 3.1b2, hmmer.org) для идентификации и извлечения АТФаз (NCVOG0249) и MCP из 235 эталонных геномов NCDLV с использованием конкретных скрытых марковских моделей (https://bitbucket.org/berkeleylab/mtg-gv- ехр /). Затем извлеченные белки были объединены с запросами Yaravirus, выровнены с MAFFT-linsi (v7.294b, (53)) (ATPase) и MAFFT (MCP), и полученные аминокислотные выравнивания были обрезаны с помощью trimal (v1.4, -gt 0.9, (54)). Филогенетические деревья были построены с использованием IQ-tree (v1.6.12, (55)) с LG + F + R5 (ATPase) и LG + F + R8 (MCP) на основе встроенной функции выбора модели (56) и 1000 ultrafast bootstrap реплики (57). Филогенетическое дерево АТФазы визуализировали с помощью iTol (v5, (58)).

Доступность данных

Данные о геноме и протеомике яравируса будут доступны после публикации рукописи.

Благодарности

Мы благодарим наших коллег из IHU (Университет Экс Марсель) и из Лаборатории де Виру (Федеральный университет штата Минас-Жерайс) за их помощь, особенно Саида Могари, Иссама Хасни, Лину Баррасси, Присциллу Боно, Эрну Крохон, Клаудим , Пауло Феррейра, Джилиан Триндади и Бетания Драмонд.Кроме того, мы благодарим Méditerranée Infection Foundation, Centro de Microscopia da UFMG, CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico), CAPES (Coordenação de Aperfeiçomento de Pessoal de Nível de Pessoal de Nível de Superior) и Gerais) за финансовую поддержку. J.A. является исследователем CNPq. B.L.S., J.A., P.C., P.V.M.B. и G.P.O. являются участниками проекта CAPES-COFECUB.

К поляризуемой термодинамике AMOEBA при фиксированной эффективности заряда с использованием подхода двойного силового поля: применение к органическим кристаллам

Первые принципы предсказания структуры, термодинамики и растворимости органических молекулярных кристаллов, которые играют центральную роль в химических, материальных, фармацевтических и технических науках, бросают вызов как функциям потенциальной энергии, так и методологиям отбора проб.Здесь мы рассчитываем абсолютную термодинамику осаждения кристаллов с использованием нового подхода с двойным силовым полем, цель которого состоит в том, чтобы поддерживать точность усовершенствованных мультипольных силовых полей (, например, поляризуемая модель AMOEBA) при выполнении более 95% отбора проб с недорогим фиксированным зарядом ( FC) силовое поле ( например, OPLS-AA). Абсолютные свободные энергии фазового перехода сублимации / осаждения кристаллов были определены с использованием алхимического пути, который вырастает кристаллическое состояние из эталонного состояния пара на основе отбора проб с силовым полем OPLS-AA с последующими термодинамическими поправками двойного силового поля для изменения между разрешениями FC и AMOEBA в обоих конечных состояниях (мы обозначаем трехступенчатый путь как AMOEBA / FC).Важно отметить, что в то время как фазовый переход требует порядка 200 нс отбора проб на соединение, для достижения термодинамических поправок двойного силового поля требовалось всего 5 нс отбора проб, чтобы достичь средней статистической погрешности 0,05 ккал моль ⁻¹ . Для пяти органических соединений средняя ошибка без знака между прямым использованием AMOEBA и двойным силовым полем AMOEBA / FC составила всего 0,2 ккал моль ^-1 и не была статистически значимой. По сравнению с экспериментальной термодинамикой осаждения средняя беззнаковая ошибка для AMOEBA / FC (1.4 ккал моль ^-1 ) было более чем вдвое меньше, чем нескорректированный OPLS-AA (3,2 ккал моль ^-1 ). В целом, термодинамические поправки двойного силового поля уменьшили выборку конденсированной фазы в дорогостоящем силовом поле в 40 раз и могут оказаться полезными для стабильности белка или термодинамики связывания в будущем.

У вас есть доступ к этой статье

геном 121137 1882..1891

% PDF-1.4 % 74 0 объект > эндобдж 71 0 объект > поток Acrobat Distiller 7.0 (Windows) 2011-10-14T05: 06: 25 + 05: 30Arbortext Advanced Print Publisher 9.1.510 / W2021-05-24T14: 56: 33-07: 002021-05-24T14: 56: 33-07: 00application / pdf

Microsoft Word — Roe_et_al_6March27_final_copy (1)

% PDF-1.5 % 1 0 obj > эндобдж 5 0 obj > эндобдж 2 0 obj > поток application / pdf