Пума – механизм раскладки(трансформации). — ADK
Диван Пума — надежный механизм.
Пума – это один из самых простых и удобных механизмов трансформации диванов, которым оснащают как прямые, так и угловые модели. Как правило, диван «пума» выбирают для постоянного использования, он очень удобен и функционален.
Особо функциональны прямые диваны, так как спальное место при их раскладывании получается достаточно просторным. У нас можно купить диван «пума» любой модификации: прямой (диван «Милан»), либо угловой (диван «Милан»), классического или современного дизайна.
Трансформация дивана Пума в спальное место происходит следующим образом
- С дивана убирают подушки.
- Верхнюю часть сиденья дивана тянут на себя, а нижняя (внутренняя) часть при этом поднимается.
- Выдвинутое вперед сиденье устанавливают на пол на специальные выдвижные ножки или опору.
- Спрятанная нижняя часть сидения становится на освободившееся место, образуя удобную кровать.
Специальный механизм синхронизации, которым снабжен каждый диван «пума», позволяет проделать всю описанную процедуру легко и быстро. Это, кстати, является одним из признаков качественной мебели. Чем проще трансформировать диван, тем качественнее механизм использован при его производстве.
Преимущества «пумы»:
Отсутствие роликов, а, следовательно, следов на полу. Это позволяет укладывать рядом с диваном любой тип напольного покрытия, включая ковры с длинным ворсом.
Комфортное спальное место. В разложенном виде такие диваны удобны для сна, они ровные и прочные. Таким образом, купить диван «пума» вполне можно для каждодневного использования, спать на нем также уютно, как и проводить дневное время.
Возможность выдерживать большие нагрузки.
Простота трансформации. При раскладывании и складывании дивана не требуется выполнять каких-либо сложных действий, трансформация выполняется одним легким движением.
Долговечность. Простой механизм прослужит долгие годы, а качественный матрас не провиснет, не потеряет свою форму и свойства.
Отсутствие ящика для белья в прямых моделях диванов. В связи с тем, что пространство под сиденьем занимает вторая часть спального места, устанавливать бельевой короб некуда. Но этот недостаток касается только прямых диванов, в угловых для хранения постельных принадлежностей приспосабливают пространство в боковом элементе (оттаманке).
В каких случаях приобретать «пуму»:
Диваны с таким механизмом трансформации достаточно универсальны и могут эксплуатироваться в помещениях различного назначения. Однако чаще всего диван «пума» выбирают все-таки для постоянного использования в качестве места для сна. И это неудивительно, покупателей привлекают, в первую очередь, простота его раскладывания и исключительный комфорт.
Мы смело можем рекомендовать купить диван «пума» и в скромную малогабаритную квартиру, и в роскошный загородный дом. Такие диваны в разном дизайне смотрятся совершенно непохоже друг на друга и способны удовлетворить любой, даже самый взыскательный вкус. Если вам нужен стильный и удобный диван, который ночью с легкостью превратится в отличное, комфортное спальное место – обратите внимание на различные модели с этим механизмом раскладки.
Механизм трансформации Пума от компании Грек
Механизм трансформации Пума совсем недавно появился в сфере мебельного производства, но уже пользуется большим признанием. Дело в том, что конструкция способна выдержать нагрузку свыше 200 кг, а принцип раскладки простой и практически не требует усилий.
Компания «Грек» выпускает механизмы трансформации любых типов. На сайте можно найти такие популярные конструкции, как Книжка, Дельфин и Пума в том числе. Помимо готовых устройств мы выпускаем все необходимые комплектующие и крепеж, чтобы можно было при необходимости быстро и недорого создавать уникальную мебель.
Описание и принцип работы устройства
Механизм трансформации диванов Пума не зря получил свое название от грациозного животного. Дело в том, что устройство работает бесшумно и очень легко. Для раскладки дивана достаточно тихонько потянуть за корпус – дальше конструкция выезжает сама. В работе устройства используется шагающий принцип – то есть нижний корпус дивана не выезжает по полу, а делает шаг вперед. Одновременно с этим спинка дивана принимает горизонтальное положение, не требуя никаких действий со стороны человека. В целом раскладка мебели занимает не более 3 секунд.
Механизм Пума компактный и не занимает много места. Но несмотря на это в разложенном состоянии такие диваны дают большое спальное место, имеют объемный бельевой ящик.
Диваны с таким устройством подходят для ежедневного применения. Они не требуют много времени на трансформацию, а сами детали служат длительное время, не подвергаясь деформации. Любовь покупателей устройство заслужило благодаря ряду достоинств:
- конструкция дивана проста, с ней может справиться ребенок и человек в возрасте;
- для раскладки не требуется усилий, особенно если использовать газовые лифты;
- диван не повреждает поверхность пола, поскольку отсутствует трение с покрытием;
- большое спальное место, а в сложенном состоянии диван занимает минимум пространства;
- конструкция может монтироваться в диваны любых моделей;
- сохраняется бельевой ящик;
- выдерживает большие нагрузки, может разместить семью с ребенком.
На сайте Вы найдете большой выбор механизмов, все виды комплектующих к ним. Цены на все товары ниже, поскольку компания «Грек» является прямым производителем и может дать гарантию того, что устройства прослужат долго без дефектов и сбоев. С нашими механизмами Вы можете создавать уникальные модели мебели без больших затрат.
Механизмы трансформации
Механизм «Пума»
Диваны с механизмом трансформации «Пума» отличаются прочностью, надежностью и являются новинкой на мебельном рынке. Простые и легкие в обращении диваны с механизмом «Пума» способны выдерживать нагрузку до 200 кг., но, не смотря на это, раскладываются за считанные секунды. Достигается это благодаря так называемому «шагающему» способу. То есть сиденье не перемещается по полу, а плавно двигается вперед. Одновременно с движением сиденья совершается подъем мягкого элемента, размещенного под сиденьем в нише. Диваны с механизмом «Пума» выглядят компактно, но, несмотря на это, в разложенном виде они превращаются в просторные угловые диваны с большим спальным местом. У таких диванов есть бельевой ящик, что делает их удобными для повседневного использования в качестве дивана-кровати.
Механизм «Hodry»
«Hodry» (Ходри) – механизм трансформации трех сложений. Раскладывается он вперед от стены. Такой механизм позволяет производить раскладывание дивана просто вытягивая сиденье на себя, то есть необходимо тянуть за царгу дивана до полного раскладывания механизма. При трансформации сидение телескопически выкатывается вперед и из-под него выходит часть спального места. При дальнейшем выкатывании вперед из нижней части спинки выходит головная часть спального места. Вернуть мебель из положения «кровать» в положение «диван» столь же просто – достаточно задвинуть сиденье плавным движением от себя. Так же возможен вариант механизма с электроприводом, управляемым с помощью пульта. Данный механизм производится в Австрии.
Механизм «Дельфин»
Механизм «Дельфин» чаще всего используется в угловом диване, превращая его в просторное посадочное место для Ваших гостей. Этот удобный и надежный механизм может изменяться по схемам модификаций, однако изменения коснутся лишь исполнения самого механизма, оставив принцип действий прежним. Выдвижная часть сидения, расположенная под каркасным основанием модели, для более удобной эксплуатации оснащена небольшими колесиками с нецарапающим покрытием. В результате трансформации диван превращается в большое и ровное спальное место. Для этого достаточно потянуть за специальную петлю, расположенную внутри передней части основного сиденья, при этом выдвижная секция выкатится вперед из ниши дивана. Если после этого потянуть за эту же петлю вверх, то вторая часть дивана окажется наравне с первой и зафиксируется, превратившись в одно сплошное спальное место.
Механизм «Книжка»
Функциональные диваны-книжка вот уже не одно десятилетие пользуются успехом на мебельном рынке. Диваны с трансформацией этого механизма не зря привлекают столько желающих их приобрести. Механизм «Книжка» долговечен, практичен, легок в использовании и не боится ежедневной эксплуатации. Для того, чтобы превратить диван-книжку в двуспальную кровать достаточно всего лишь слегка выдвинуть и приподнять основную часть дивана (сиденье), после чего сработает механизм и опустится спинка. Трансформировать мягкую мебель с механизмом «Книжка» в обратное положение также просто. Примечательно то, что использовать мебель с таким простым механизмом сможет даже ребенок, ведь он срабатывает почти автоматически. Также модели с данным механизмом оснащены вместительным бельевым ящиком, куда можно с легкостью поместить все спальные принадлежности.
Механизм «Еврокнижка»
Мебель с механизмом трансформации «Еврокнижка» без сомненья одна из самых простых и долговечных в использовании. Для трансформации дивана в просторную двуспальную кровать необходимо немного выдвинуть основную часть — сиденье и опустить на освободившееся место спинку. Модели с использованием этого механизма также просты и надежны в эксплуатации и не боятся ежедневного использования. Механизмы трансформации изготовлены из качественных материалов и имеют запас прочности, многократно превышающий допустимые нагрузки. Конструкция диванов с механизмом трансформации «Еврокнижка» отличается полным отсутствием каких-либо швов, впадин и других недостатков. В результате трансформации диван представляет собой идеально ровное, удобное спальное место с нишевым бельевым ящиком.
Выкатной механизм
Модели с трансформацией выкатного механизма являются долговечными и также очень просты в применении. Для превращения дивана в просторное спальное место необходимо потянуть за ремешок сидения, находящийся в потайной части корпуса и выдвинуть диван до полного раскладывания. При трансформации в кровать передняя часть тянет за собой остальные. Диваны с таким механизмом отлично подойдут для ежедневного использования и что примечательно, не будут занимать много места в силу своей компактности.
Как работает механизм трансформации диванов пума
Опубликовано: 02.04.2018, Просмотров: 2183
Развитие мебельной индустрии привело к появлению новых механизмов и конструкций, особенно прогресс ощутим при выборе дивана, оборудованного механизмом трансформации. В данном материале речь пойдет о механизме трансформации диванов под названием пума.
Выбор дивана является достаточно сложным процессом, если нет четких представлений о приобретаемой мебели. Производители предлагают широчайший ассортимент диванов, каждый из которых отличается по форме, размерам, используемым материалам и механизмам. Классическим местом установки дивана считается гостиная, однако, последнее время встретиться данную категорию мебельных изделию можно и в прихожих, и в спальнях, и даже на кухне. Это обусловлено удобством и функциональностью современных моделей, а большой выбор внешнего оформления позволяет без труда подобрать конструкцию для любого интерьера.
Что такое диван-пума
Многие используют диваны не только для комфортного размещения в сидячем положении, но и в качестве места для полноценного ночного отдыха и сна. Для использования в качестве кровати, диван должен быть оборудован механизмом трансформации, позволяющим изменять положение элементов конструкции и получать в итоге ровную горизонтальную поверхность, пригодную для сна. Одним из самых надежных и удобных механизмов является пума, оригинальное название которого происходит из-за схожести процесса трансформации с прыжком пумы.
Для того, чтобы трансформировать диван с механизмом пума, необходимо сначала убрать с поверхности имеющиеся подушки, после чего потянуть на себя сидение дивана, которое начнет слегка приподниматься. При доведении данной фазы до конечной точки, образовавшаяся ниша заполниться второй половиной спального места, которое прежде было скрыто в нижней части конструкции. В результате получается ровная поверхность, на которой отсутствуют какие-либо ощутимые стыки и перепады высот. Сам процесс трансформации занимает несколько секунд и не требует приложения значительных усилий.
Преимущества и недостатки механизма пума
Помимо простоты и легкости трансформации, моделям, оборудованным механизмом данного типа свойственны и другие неочевидные преимущества. В процессе раскладывания дивана нельзя каким-либо образом повредить напольное покрытие, чего нельзя сказать и выдвижных и выкатных конструкциях. Принцип работы механизма обеспечивает равномерное распределение нагрузки по всем элементом, а плавный и легкий ход при трансформации позволяет на протяжении длительного времени сохранять исправность и работоспособность всех элементов конструкции.
Немаловажным фактором является то, что диваны с данным механизмом не требуют дополнительного пространства для преобразования в спальное место, что позволяет рационально использовать свободную площадь и устанавливать подобные диваны в небольших помещениях. Среди негативных качеств можно выделить лишь отсутствие бельевых ящиков, так как внутреннее пространство дивана заполнено дополнительной частью для образования спального места. Данного недостатка лишены угловые модели, в которые бельевые ящики оборудуются в дополнительной секции дивана. Выбрать подходящую модель дивана с механизмом пума можно с помощью каталога нашего сайта, где размещены предложения от разных продавцов.
Мебельный механизм трансформации Пума | Нота Мебель. Мягкая и корпусная мебель в Санкт-Петербурге.
Мебельный механизм трансформации Пума | Нота Мебель. Мягкая и корпусная мебель в Санкт-Петербурге.Механизм трансформации «Пума»
Одно из преимуществ механизма «Пума» — это отсутствие роликов, что позволяет избежать повреждения поверхности пола. Высокотехнологичный механизм трансформации, существенно облегчающий усилия необходимые для трансформации дивана в кровать и обратно. Сиденье совершает шаг вверх и вперёд, вторая часть спального места из внутренней ниши, поднимается вверх до уровня сиденья дивана. Две половины спального места имеют наполнитель равной высоты и плотности. Механизм пума изготовлен из металла, снабжён системой пружин и противовесов, уменьшающих усилие необходимое для разборки-сборки дивана. Система трансформации пума существенно улучшает комфорт и срок эксплуатации мягкой мебели.
МЫ В СОЦСЕТЯХ МЦ Мебель Холл ст.м. «Ладожская»пл. Карла Фаберже, 8
1 этаж, стенд II — 124
тел.: +7 (921) 901-64-81
Время работы: c 11:00 до 20:00 ТК МЕБЕЛЬВУД ст.м. «ул. Дыбенко»
1 этаж, стенд 118
тел.: +7 (921) 901-64-85
Время работы: c 11:00 до 21:00 МЦ 12 СТУЛЬЕВ ст.м. «Купчино»
Балканская пл., д.5
2 этаж, стенд В-9
тел.: +7 (921) 901-64-52
Время работы: c 11:00 до 20:30 МЦ Мебель Сити ст.м. «Старая деревня»
ул. Мебельная, д.1
1 этаж, стенд 39
тел.: +7 (921) 905-14-96
Время работы: c 11:00 до 20:30 МЦ Богатырь ст. м. Пионерская или Комендантский
Богатырский пр. 18, к.2
1 этаж, стенд -46
тел. +7 (921) 905-14-98
Время работы: с 11:00 до 20:30 МЦ Аквилон ст. м. «Лесная»
Новолитовская ул., д. 15Д
2 этаж, стенд 209
тел. +7 (911) 164-47-85
Время работы: с 10:30 до 20:00 ТЦ Юго-запад ст. м. «Ленинский пр.»
Пр. Маршала Жукова, д. 35, к. 1
3 этаж, стенд 39-1
тел. +7(921) 856-82-80
Время работы: с 11:00 до 21:00 МЦ Гранд Каньон ст. м. «Пр. Просвещения»
ул. Шостаковича, 8, корп. 1
4 этаж, стенд 420
тел. +7 (921) 860-85-10
Время работы: с 11:00 до 21:00 ТЦ Мебель-Сити-2 ст. м. «Лесная»
ул. Кантемировская, д.37
3 этаж, стенд 3.21
тел. +7 (931) 394-47-56
Время работы: с 11:00 до 21:00 ТЦ Кубатура ст. м. «Бухарестская», «Международная»
ул. Фучика, д.9
1 этаж, стенд 1. 165
тел. +7(981)143-49-28
Время работы: с 11:00 до 18:00
что это такое, принцип работы, плюсы и м
От правильного выбора дивана зависит комфорт и здоровье. Этот предмет мебели также способен преобразить интерьер. При покупке дивана в качестве основного места для сна стоит учитывать и особенности механизма его трансформации, который должен отличаться прочностью и надёжностью.
Пума — современный шаговый механизм трансформации, который завоевал большую популярность. Название происходит из-за сходства процесса раскладывания с движением этого необычного животного во время прыжка.
Конструкция проста, но очень надёжна. Такой механизм способен выдерживать нагрузки до 200 кг. Он долговечен, удобен в эксплуатации и подходит для ежедневного использования. При желании, одним легким движением можно превратить компактный диван в удобную двуспальную кровать.
Раскладной диван с шагающим механизмом Пума идеально подходит для ежедневной эксплуатации в качестве спального места.
Разложить такую конструкцию очень легко. Эта задача потребует минимум времени и усилий.
В конструкции используется шагающий принцип: при трансформации передняя подушка движется вперёд, а задняя автоматически поднимается.
Механизм Пума значительно отличается от других механизмов своей простотой и устойчивостью к износу. Он работает бесшумно и плавно, кроме того, нет необходимости применять силу, чтобы привести его в действие.
Процесс раскладки достаточно прост и занимает не более 3-х секунд. При трансформации не происходит дополнительного соприкосновения с полом, поэтому можно не переживать за дорогой паркет или покрытие. Превратить такой диван в кровать можно с помощью нескольких простых шагов:
- Плавное приподнять и потянуть сидение на себя.
- Опустить его на пол.
Готово. Перед трансформацией не забудьте убрать с дивана лишние элементы (вещи, декоративные подушки, игрушки).
Фото: Трансформация дивана ПумаЧтобы сложить его нужно выполнить последовательность действий выполняемую при раскладке, но уже в обратном порядке.
Для улучшения характеристик спального места советуем использовать топпер — тонкий беспружинный матрас, который способен убрать все неровности и сделать место для сна максимально комфортным.
Для наглядного представления о том, как работает механизм трансформации диванов Пума советуем посмотреть следующее видео:
Видео: Механизм «Пума» в диванах и принцип его работыДиваны Пума пользуются большим спросом, благодаря продуманной системе раскладывания. Этот элемент мебели органично впишется в любой интерьер. В ассортименте угловые, прямые и модульные диваны. Все модели сочетают в себе удобство и практичность.
Отличаются компактностью, а также разнообразием дизайна. Мебель этого типа экономит пространство в сложенном виде, при этом его легко трансформировать в полноценное спальное место.
Модель «Глория» от фабрики ЭлегияЭтот вариант идеально впишется в интерьер гостиной или кухни. Он легко превращается в кровать для сна и отдыха. Такая функция особенно полезна в тех случаях, когда приезжают родственники или приходят гости. Лучше всего такие модели смотрятся в просторных светлых помещениях, они придают комнате дополнительный уют.
Преимуществом угловых моделей является наличие в боковой секции ящика для постельных принадлежностей.
Главным достоинством модульного дивана является его максимальная мобильность. Такая мебель отлично подойдёт тем, кто часто делает перестановку в комнате. Модульные конструкции позволяют создавать уникальные стили интерьера, воплощая оригинальные дизайнерские фантазии. Комплекс подойдёт для таких модных направлений, как лофт, контемпорари, хай-тек и других.
Среди главных плюсов покупатели отмечают:
- Не нужно отодвигать от стены, чтобы разложить его.
- Лёгкость раскладывания, подойдёт для людей любого возраста.
- Не царапает пол. Перед и под таким диваном можно постелить любое ковровое покрытие.
- Ровное и удобное спальное место, которое не вредит осанке и здоровью спины.
- Выдерживает большие нагрузки и равномерно её распределяет, что увеличивает срок службы изделия.
Мебель с шаговым механизмом Пума завоевала рынок благодаря прочности, функциональности и долгому сроку службы. Сегодня такой мебелью оснащают различные помещения от загородных домов, до небольших городских квартир.
Из недостатков можно отметить лишь отсутствие ящиков для хранения постельных принадлежностей в прямых моделях.
Диваны с шаговым механизмом Пума отличаются не только цветом и формой, но также обивкой и наполнением. Подобрать мебель под любой вкус и стиль интерьера не составит труда. Механизм Пума станет идеальным решением для тех, кто хочет сэкономить пространство без ущерба для сна и отдыха.
Выбор механизма раскладки дивана. Обзор всех механизмов трансформации.
Планируете купить раскладной диван, но не знаете какой выбрать механизм раскладки?
Каждый из современных механизмов трансформации хорош по-своему, но, к сожалению, не все они универсальны.
В каталоге нашего интернет-магазина представлены следующие механизмы раскладки диванов: «Софа», «Книжка», «Еврокнижка», «Аккордеон», «Французская раскладушка», «Дельфин», «Пума», «Пантограф», «Ножницы», «Конрад». Вкратце пройдемся по главным отличительным особенностям каждого из них.
«Диван-книжка» (клик-клак)
Конструкция отличается простотой и неприхотливостью. Долговечность и невысокая стоимость обеспечиваются отсутствием сложных узлов и деталей, которые могли бы с течением времени выйти из строя. «Книжка» производится только в виде прямого дивана.
Чтобы разложить «Книжку», нужно поднять блок сидения до характерного щелчка, положив спинку, и затем опустить обратно. Следует принять во внимание, что для этого потребуется некоторое усилие. Взрослый человек легко справится с таким видом трансформации, но детям понадобится ваша помощь.
Также стоит учесть то, что «Книжку» нужно устанавливать с небольшим расстоянием от стены, чтобы спинка не упиралась в нее во время трансформации. В основании дивана, по вашему усмотрению, может быть установлен большой бельевой короб. Ширина спального места — 142 или 152 см, на выбор.
Диван с механизмом раскладки «Книжка»
«Еврокнижка»
Надёжная и простая раскладка, с которой справится даже ребенок. Поверхность спального места — ровная и удобная, без стыков.
При раскладывании блок сидения выкатывается вперед, затем на свободное место опускается спинка. Колёсики, прикрепленные снизу, позволяют легко и быстро раскладывать диван, не повредив напольное покрытие.
«Еврокнижка» — один из самых доступных видов диванов по стоимости. Удобен для небольших комнат, так как занимает совсем немного места даже в разложенном виде (благодаря тому, что постель располагается вдоль сиденья).
В каталоге представлено множество моделей, как прямых, так и угловых, оснащенных механизмом «Еврокнижка». По вашему желанию диван комплектуется бельевым коробом. Также есть возможность выбора разновидности матраса (пружинный блок, либо ППУ).
Диван «Амелия» с механизмом раскладки «Еврокнижка»
Диван «Валенсия» с механизмом раскладки «Еврокнижка»
«Аккордеон»
Эта разновидность трансформации — одна из наиболее популярных. Привлекает простота и скорость преобразования дивана в кровать, стоит только поднять сидение до щелчка и потянуть за ремешок, после чего все части матраса выдвинутся в единую ровную спальную поверхность, просторную и комфортную, без стыков и швов.
В сложенном виде «диван-аккордеон» очень компактен, однако при раскладывании он занимает много места в помещении, поскольку все части матраса выдвигаются вперед.
По причине своей габаритности, для узких комнат такой тип трансформации не подойдет, но в просторных комнатах, будь то спальня или гостиная, «Аккордеоны» пользуются большой популярностью.
Диван «Даллас» с механизмом раскладки «Аккордеон»
Диван «Дрезден» с механизмом раскладки «Аккордеон»
«Французская раскладушка» или «Седафлекс»
Легкий и компактный диван, при трансформации напоминающий настоящую раскладушку. Конструкция предназначена для периодического использования в гостиной, прихожей или холле в качестве гостевого варианта. Очень удобный и комфортный вид, если его использовать для дневного или вечернего отдыха.
Однако тонкий матрас «Седафлекса» не обладает ортопедическими свойствами, поэтому не желательно спать на нем ежедневно. Под сидением расположено спальное место в свернутом виде.
Чтобы разложить «Французскую раскладушку», нужно снять сидение и развернуть матрас. Поскольку матрас занимает всё свободное пространство под сиденьем, «Седафлексы» не содержат короба для белья.
«Дельфин»
Очень распространенный, популярный вид трансформации. Это обусловлено простотой и удобством эксплуатации, прочностью механизма и универсальностью дивана.
«Дельфины» способны выдержать большую нагрузку и могут использоваться для ежедневного ночного отдыха. Чтобы подготовить спальное место, необходимо выкатить раму на колесиках и потянуть вверх за ремень, чтобы блок матраса «вынырнул» на поверхность.
Дельфины» не портят пол или напольное покрытие, их можно устанавливать в любой комнате дома. Угловые модели особенно удобны, просторны и эргономичны, они имеют шикарные широкие поверхности для сна и содержат большие ниши для белья.
Диван «Роланд» с механизмом раскладки «Дельфин»
Диван «Даллас» с механизмом раскладки «Дельфин»
«Пума»
Один из новых видов трансформации мягкой мебели, успевший завоевать сердца покупателей своим шикарным дизайном и функциональностью. Таким механизмом оснащены модульные диваны фабрики «Константа».
Раскладка производится достаточно просто, быстро и бесшумно, не повреждая пол или покрытие. Чтобы разложить «Пуму» нужно приподнять сидение и потянуть его на себя (подобно «Еврокнижке»). Диван «Пума» может использоваться для ежедневного сна. Угловые модели содержат большие ниши для постельного белья, в прямых моделях — их нет.
Диван «Бозен 4» с механизмом раскладки «Пума»
Диван «Бозен Lite 3» с механизмом раскладки «Пума»
«Пантограф»
Диваны с механизмом «Пантограф» называют «шагающими диванами». Эту разновидность отличает долговечность, практичность и простота конструкции. Подобно «Еврокнижкам», «Пантограф» раскладывается вперед и имеет все положительные стороны первых. При трансформации сидение как-бы «делает щаг» вперед, перемещаясь в пространстве и не касаясь пола. Спинка опускается горизонтально на освободившееся место. Для раскладки требуется небольшое усилие, чтобы приподнять сиденье. Но зато в диванах «Пантограф» при трансформации напольное покрытие не контактирует с раздвигающимся блоком, и, соответственно, даже не примнется роликами, как в выкатных моделях (здесь они отсутствуют).
Производятся как прямые, так и угловые модели «Пантограф», и те и другие вполне подходят для частой раскладки и ночного отдыха.
Диван «Турин» с механизмом раскладки «Пантограф»
Диван «Монако» с механизмом раскладки «Пантограф»
«Ножницы»
Диваны с поворотным механизмом при раскладке напоминают ножницы, чем и «заслужили» такое название. Для образования спального места необходимо повернуть одну из частей матраса (подвижную) на 90 градусов и зафиксировать обе части вместе при помощи крючка. К низу подвижной части прикреплены колесики, облегчающие трансформацию.
«Ножницы» — долговечный и очень надежный механизм, который рассчитан на длительную работу и каждодневные нагрузки. Используя для ежедневного сна в диванах с поворотным механизмом пружинный матрас, вы получаете достойную замену кровати с ортопедическим матрасом.
Угловые модели «Ножниц» имеют большие ниши для белья. Фабрика «Константа» производит также прямой диван «Ножницы» — (модель «Дублин») — стильный, комфортный и компактный, оснащенный металлокаркасом и буковыми ламелями для улучшения ортопедических качеств.
Диван «Техас» с механизмом раскладки «Ножницы»
Диван «Фаворит» с механизмом раскладки «Ножницы»
«Конрад»
«Конрад» имеет шикарный современный дизайн, спальное место состоит из трех частей — две из которых в сложенном состоянии спрятаны под сиденьем, третья — само сиденье.
При трансформации нижняя часть матраса выкатывается вперед, после чего, потянув за петлю, ее необходимо поднять на один уровень с сиденьем. При дальнейшем, полном выдвижении из-под сидения покажется еще одна часть, третья. Такой вид раскладки может быть использован ежедневно, либо в качестве гостевого варианта.
Спальное место — просторное, с едва ощутимыми стыками. При желании, можно положить сверху топпер, который сделает поверхность идеально ровной. В боковом сегменте — большая ниша для постельных принадлежностей. «Конрад» раскладывается вперед и занимает достаточно много места, поэтому он не подойдет для узких помещений. Устанавливать его можно в больших, просторных комнатах, где его удобно раскладывать.
«Софа»
«Софа» — очень изящный и в сложенном виде компактный вид мягкой мебели. Раскладка производится по направлению вперед, для этого нижняя часть выдвигается из-под сиденья и на нее укладывается матрас (с пружиной типа Bonnel, либо ППУ). По вашему желанию модели комплектуются бельевым коробом. Этот маленький диванчик может стать украшением любой комнаты — гостиной, прихожей или спальни.
Диван «Вена» с механизмом раскладки «Софа»
Выбор механизма трансформации дивана — весомая составляющая, отнеситесь к ней со всей ответственностью и Ваша мебель будет баловать Вас комфортом на протяжении многих лет.
(PDF) Генетическое определение механизма апоптоза, индуцированного Puma и Bim
в другом месте.
41
Bid / Bim / p53-дефицитные мыши были получены путем скрещивания Bid
/
/
Bim
/
и p53
/
животных. Полученное потомство скрещивали с получением(C57BL6 / SV129) мышей TKO. Все процедуры с животными были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных детской исследовательской больницы St. Jude
.
Миелосупрессивный режим. Мышам внутривенно вводили 80 мг / кг карбоплатина (SICOR
Pharmaceuticals, Inc., Ирвин, Калифорния, США), а затем вводили
7,5 Гр общей ионизирующей радиацией всего тела в течение указанного периода при одновременном применении антибиотика
Байтрил.
11
Всех мышей ежедневно наблюдали на предмет признаков заболеваемости и развития опухоли
. Ткани больных или умирающих мышей фиксировали в 4% параформальдегиде
для последующей гистопатологической оценки.
Анализ крови. Кровь собирали в 20-литровые микрокапиллярные пробирки, покрытые ЭДТА,
(Fisher Scienti ‑ fc, Питтсбург, Пенсильвания, США). Количество лейкоцитов, концентрацию гемоглобина
и количество тромбоцитов определяли с использованием системы FORCYTE Hematology System
(Oxford Science, Inc., Оксфорд, Коннектикут, США).
Выделение первичных миелоидных клеток костного мозга, культивирование и обработка
. Костный мозг выделяли из задней бедренной и большеберцовой костей WT,
Bim
/
, Puma
/
и Puma
/
/ Bim
мышей.Первичные миелоидные клетки были
, последовательно генерировались, как описано в другом месте, и культивировались в RMPI-1640
с добавлением 15% FBS, 1% P / S, 10 мМ глутамина, 10 нг / мл мыши
рекомбинантный SCF (R&D), 10 нг / мл рекомбинантного IL-6 мыши (R&D) и 40 ед / мл
рекомбинантного IL-3 мыши.
15,16
Через 3 недели культивирования с регулярной сменой сред
иммунофенотип определяли методом проточной цитометрии. Установлено
гомогенных культур клеток, полученных из костного мозга: Sca-1
cKit
, отрицательных
для F4 / 80, GR-1 / Ly6G, CD4, CD8, B220 и Ter-119 и положительный для FcR1.Первичные
CTMC дважды промывали HBSS и ресуспендировали в среде без цитокинов
перед воздействием ИК (5 Гр) или ABT-737 (1 мМ). Клетки инкубировали в течение указанных
периодов времени и клеточных ответов по сравнению с клетками, культивированными в присутствии
цитокинов.
Определение жизнеспособности клеток и апоптоза. Концентрацию клеток и жизнеспособность
оценивали по исключению трипанового синего с использованием автоматического анализатора Vi-CELL
(Beckman Coulter, Бреа, Калифорния, США).Апоптоз определяли с помощью цитометрической оценки потока
в популяции с положительным аннексином V. Образцы
дважды промывали ледяным PBS и окрашивали AnnexinV-APC и 7-AAD в соответствии с инструкциями производителя
(BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния, США).
Выделение белков и вестерн-блоттинг. Клетки собирали,
промывали в PBS и ресуспендировали в буфере CHAPS (1% CHAPS, 10 мМ HEPES, pH
7,4, 150 мМ NaCl), содержащем таблетку полного мини-ингибитора протеазы (Roche, Applied
Science, Indianapolis, IN, США), ингибиторы фосфатазы и 1 мМ PMSF (Sigma-
Aldrich).Лизаты инкубировали на льду в течение 30 минут, а супернатанты собирали
после центрифугирования при 13000 g в течение 15 минут. Концентрации белка составляли
, определенные с помощью анализа BCA (Thermo Scientifc, Rockford, IL, USA), как описано
в инструкциях производителя. Экспрессию белка (50 мг / дорожка для экспериментов с клетками
и изолированными митохондриями) определяли электрофорезом в SDS-полиакриламидном геле
(PAGE) и последующим вестерн-блот-анализом (Invitrogen,
Carlsbad, CA, USA).Вестерн-блот-фильтры зондировали указанными первичными антителами
, а затем вторичными антителами
, конъюгированными с пероксидазой хрена (KPL, Inc., Гейтерсбург, Мэриленд, США). Белки визуализировали с использованием системы усиленной хемилюминесценции
(ECL) (Thermo Scienti c) с последующим воздействием пленок
CL-Xposure (Kodak, Рочестер, Нью-Йорк, США).
Иммунопреципитация активированного Bax. Для обнаружения активной формы Bax собирали
первичных CTMC и лизировали в буфере для лизиса CHAPS на льду.Brie 9y,
активированный Bax был иммунопреципитирован из 500 мг лизатов целых клеток с клоном моноклонального антитела
6A7 (Sigma-Aldrich), которое реагирует только с Bax в его конформационно активном состоянии
, и протеин G Sepharose 4 Fast Flow Beads.
(Амершам, Литл-Чалфонт, Великобритания). Затем выделенные активные образцы Bax подвергали
Вестерн-блоттингу и идентифицировали с помощью кроличьих поликлональных антител против Bax (N-20; Santa
Cruz Biotechnology) и ECL, как описано выше.
Клеточная проницаемость и анализ MOMP. Первичные CTMC
(5 10
6
/ образец) собирали, промывали в PBS и инкубировали на льду в течение 5 минут
в буфере для проницаемости (20 мМ HEPES, pH 7,2, 100 мМ KCl, 5 мМ MgCl
2
, 1 мМ
EDTA, 1 мМ EGTA, 250 мМ сахарозы и 0,015% дигитонина из 10% исходного раствора ДМСО)
, содержащая таблетку полного ингибитора протеазы Mini. Затем добавляли белки, пептиды и ABT-737
(конечные концентрации указаны в подписях к рисункам) и клетки
инкубировали при 30 ° C в течение 1.25 ч. Образцы центрифугировали 10 мин в 4 1Cat
15 000 мкг. Супернатанты собирали и анализировали с помощью SDS-PAGE и вестерн-блоттинга
с антицитохромом с (клон 7H8.2C12).
Учреждение Брду. Первичные миелоидные клетки метили 10 мМ 5-бром-
20-дезокси-уридином (BrdU) в течение 24 часов при 37 ° C в асептических условиях. Клетки собирали
, и включение BrdU определяли с использованием «APC BrdU Flow Kit»
в соответствии с инструкциями производителя с использованием проточного цитометра FACScalibur
(BD Biosciences).
Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Благодарности. Мы благодарим доктора Карла Джексона за его совет относительно миелосупрессивного режима
на моделях мышей. Мы благодарим Центр Хартвелла и
Центр проточной цитометрии и сортировки клеток в Детской исследовательской больнице Св. Джуда за
их техническую помощь. Эта работа была частично поддержана грантами NIH и NIH /
NCI Cancer Center Support CORE Grant CA21765.Мы также благодарны
Американско-ливанской сирийской ассоциации благотворительных организаций (ALSAC) Исследовательской больницы
Детского центра Св. Иуды за их щедрую поддержку.
1. Thompson CB. Апоптоз в патогенезе и лечении заболеваний. Science 1995;
267: 1456–1462.
2. Чипук Ю.Е., Грин DR. PUMA взаимодействует с белками-активаторами прямого действия, чтобы способствовать проницаемости внешней мембраны митохондрий и апоптозу. Cell Cycle
2009; 8: 2692–2696.
3. Оберст А, Бендер С, Грин DR. Жизнь со смертью: эволюция митохондриального пути апоптоза
у животных. Cell Death Differ 2008; 15: 1139–1146.
4. Уиллис С. Н., Адамс Дж. М.. Жизнь на волоске: как белки, содержащие только Bh4, вызывают апоптоз. Curr
Opin Cell Biol 2005; 17: 617–625.
5. Юле Р.Дж., Штрассер А. Семейство белков BCL-2: противоположные активности, опосредующие гибель клеток.
Nat Rev Mol Cell Biol 2008; 9: 47–59.
6.Letai A, Bassik MC, Walensky LD, Sorcinelli MD, Weiler S, Korsmeyer SJ. Отдельные домены Bh4
либо сенсибилизируют, либо активируют митохондриальный апоптоз, служа прототипом лечения рака
. Cancer Cell 2002; 2: 183–192.
7. Михара М., Эрстер С., Заика А., Петренко О., Читтенден Т., Панкоска П. и др. p53 имеет прямую апоптогенную роль
в митохондриях. Mol Cell 2003; 11: 577–590.
8. Leu JI, Dumont P, Hafey M, Murphy ME, George DL. Митохондриальный p53 активирует Bak, а
вызывает нарушение комплекса Bak-Mcl1.Nat Cell Biol 2004; 6: 443–450.
9. Чипук Дж. Э., Кувана Т., Бушье-Хейс Л., Дроин Н. М., Ньюмейер Д. Д., Шулер М. и др. Прямая активация
Bax p53 опосредует проницаемость митохондриальной мембраны и апоптоз
. Science 2004; 303: 1010–1014.
10. Ким Х., Рафуддин-Шах М., Ту Х.С., Джефферс Дж. Р., Замбетти Г. П., Сие Дж. Дж. И др. Иерархическая
регуляция митохондрион-зависимого апоптоза подсемейством BCL-2. Nat Cell Biol 2006;
8: 1348–1358.
11. Пестина Т.И., Кливленд Дж. Л., Ян К., Замбетти Г. П., Джексон К. В.. Лиганд Mpl предотвращает смертельную миелосупрессию
, ингибируя р53-зависимый апоптоз. Blood 2001; 98: 2084–2090.
12. Packham G, White EL, Eischen CM, Yang H, Parganas E, Ihle JN et al. Селективная регуляция
Bcl-XL с помощью Jak-киназозависимого пути обходится при злокачественных гемопоэтических опухолях у мышей
. Genes Dev 1998; 12: 2475–2487.
13. Quelle FW, Wang J, Feng J, Wang D, Cleveland JL, Ihle JN et al.Спасение цитокинов p53-
-зависимого апоптоза и остановки клеточного цикла опосредуется различными путями передачи сигналов киназы Jak
. Genes Dev 1998; 12: 1099–1107.
14. Эрлахер М., Лаби В., Манцл С., Бок Г., Цанков А., Хакер Г. и др. Puma взаимодействует с
Bim, ограничивающим скорость только белком Bh4 в гибели клеток во время развития лимфоцитов, в индукции апоптоза
. J Exp Med 2006; 203: 2939–2951.
15. Джефферс Дж. Р., Парганас Э., Ли Й., Ян С., Ван Дж., Бреннан Дж. И др.Пума является важным медиатором
p53-зависимых и -независимых путей апоптоза. Cancer Cell 2003; 4:
321–328.
16. Филипс, округ Колумбия, Гарнизон, СП, Джефферс Дж. Р., Замбетти, GP. Анализы для измерения р53-зависимого и
-независимого апоптоза. Методы Мол Биол 2009; 559: 143–159.
17. Экофф М., Штрассер А., Нильссон Г. Агрегация FcepsilonRI способствует выживанию соединительных
тканеподобных тучных клеток, но не тучных клеток, подобных слизистой оболочке. J Immunol 2007; 178: 4177–4183.
18. Canman CE, Gilmer TM, Coutts SB, Kastan MB. Модуляция фактора роста p53-
, опосредованная задержкой роста по сравнению с апоптозом. Genes Dev 1995; 9: 600–611.
19. Чипук Дж.Э., Молдовяну Т., Лламби Ф., Парсонс М.Дж., Грин Д.Р. Воссоединение семьи BCL-2.
Mol Cell 2010; 37: 299–310.
20. Урен Р.Т., Девсон Дж., Чен Л., Койн С.К., Хуанг Д.К., Адамс Дж. М. и др. Митохондриальная проницаемость
зависит от лигандов Bh4, участвующих в нескольких выживших родственниках Bcl-2, а не
Bak.J Cell Biol 2007; 177: 277–287.
Puma и Bim в токсичности костного мозга
SP Garrison et al
648
Смерть и дифференциация клеток
Сенсоры, содержащие только Bh4 Плохие, Noxa и Puma являются ключевыми регуляторами апоптоза, индуцированного вирусом Такарибе
Hol Switzerland J, Fénéant L, Banadyga L, Hölper JE, Knittler MR, Groseth A (2020) Датчики только для Bh4 Bad, Noxa и Puma являются ключевыми регуляторами апоптоза, индуцированного вирусом Tacaribe. PLoS Pathog 16 (10): e1008948.https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008948
Редактор: Йенс Х. Кун, Отдел клинических исследований, СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ
Поступила: 3 июня 2020 г .; Одобрена: 31 августа 2020 г .; Опубликовано: 12 октября 2020 г.
Авторские права: © 2020 Hol Switzerland et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.
Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в рукописи и ее файлах с вспомогательной информацией.
Финансирование: Эта работа финансировалась Deutsche Forschungsgemeinschaft (www.dfg.de; номер гранта 324484564 для AG) и Friedrich-Loeffler-Institut (www.fli.de) через внутреннее финансирование в рамках программы VISION. консорциум. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.
Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.
Введение
Семейство аренавирусов состоит в основном из вирусов, переносимых грызунами, хотя недавно были идентифицированы вирусы, исключительно связанные с рептилиями [1]. Классические аренавирусы млекопитающих далее подразделяются на аренавирусы Старого Света (OW) и Нового Света (NW) в соответствии с их антигенными свойствами, географическим распространением и филогенезом [2, 3].Несмотря на это, все они имеют общую структуру, состоящую из обернутой частицы, содержащей двусегментированный геном РНК с отрицательной цепью, причем оба сегмента кодируют две открытые рамки считывания (ORF) в амбисенсном кодирующем устройстве [4]. Малый сегмент генома (сегмент S) кодирует гликопротеин (GP) и нуклеопротеин (NP), тогда как большой сегмент генома (сегмент L) кодирует полимеразу (L) и матричный белок (Z) [5].
Хотя аренавирусы обладают такой ограниченной кодирующей способностью, они включают ряд известных патогенов человека.Например, несколько аренавирусов NW вызывают тяжелые заболевания геморрагической лихорадки (HF) с неврологическими проявлениями в географически ограниченных регионах Южной Америки. Наиболее изученным из этих вирусов является вирус Хунин (JUNV), который является эндемичным для сельскохозяйственных регионов центральной Аргентины и вызывает аргентинскую геморрагическую лихорадку [6–9]. Напротив, близкородственный вирус Tacaribe (TCRV) неизвестен как вызывающий заболевание человека в естественных условиях, хотя, по-видимому, он способен инфицировать людей, о чем свидетельствуют редкие симптоматические лабораторные инфекции [10].В настоящее время причина этих различий в патогенности остается неясной, хотя вполне вероятно, что различия в способности вирулентных и авирулентных аренавирусов модулировать ответы клеток-хозяев играют определенную роль. Текущие данные свидетельствуют о том, что аренавирусы регулируют как продукцию интерферона типа I (IFN-I), так и передачу сигналов ядерного фактора-κB (NFκB) посредством ингибирующих взаимодействий NP и Z с компонентами хозяина этих сигнальных путей (обзор в [11]). Есть также доказательства того, что регуляция апоптоза аренавирусами может играть важную роль в инфекции и быть связана с патогенезом (см. Обзор [12]).
Апоптоз — это невоспалительный процесс запрограммированной гибели клеток, который приводит к фрагментации клетки и высвобождению заключенных в мембрану остатков клеток (апоптотических тел), которые обогащены фосфатидилсерином (PS), что делает их мишенями для удаления фагоцитарными клетками через PS-рецепторы (обзор в [13]). Еще одним отличительным признаком апоптоза является то, что он включает упорядоченную деградацию компонентов клетки-хозяина под действием цистеин-аспарагиновых протеаз (каспаз; Casp), которые активируются в результате протеолитического расщепления неактивным проферментом в ответ на клеточный стресс или повреждение.Однако, хотя было описано много различных каспаз, только часть из них связана с апоптозом. Среди них инициаторные каспазы, то есть Casp8, 9 и 10, в основном ответственны за активацию нижестоящих исполнительных каспаз, то есть Casp3 и 7, которые затем в первую очередь ответственны за деградацию компонентов клетки-хозяина (см. Обзор [14]; Рис. 1). .
Рис. 1. Индукция апоптоза через внешние и внутренние пути.
Внешняя активация апоптоза происходит через связывание проапоптотических лигандов, таких как FasL, TRAIL или TNF-α, с их соответствующими «рецепторами смерти» и опосредует образование сигнального комплекса, индуцирующего смерть (DISC), в сочетании с инициатором. каспазы 8 и / или 10.Это, в свою очередь, активирует эти каспазы и приводит к последующей активации эффекторных каспаз 3 и / или 7. Напротив, внутренняя активация происходит через различные пути передачи сигнала и может запускаться различными клеточными стрессорами (например, реактивными формами кислорода, стрессом ER , Повреждение ДНК), которые часто распознаются клеточными киназами (например, p38, Akt, PI3K, ERK1 / 2). Эти сигнальные молекулы могут затем передавать «сигналы опасности» либо непосредственно проапоптотическим белкам, содержащим только Bh4, либо через родственные регуляторные факторы, такие как p53.После активации белки, содержащие только Bh4, способствуют проницаемости внешней мембраны митохондрий за счет активации олигомеризации Bak / Bax прямо или косвенно (т. Е. Путем антагонизма антиапоптотических белков Bcl-2). Результирующая олигомеризация Bak и / или Bax приводит к образованию структур пор, через которые Cyt c выходит с образованием апоптосомы (вместе с Apaf-1), которая затем активирует инициаторную каспазу 9, а затем эффекторные каспазы 3 и / или 7. Активность каспазы приводит к деградации различных компонентов белка-хозяина, что в конечном итоге приводит к гибели клеток, а также к необратимой презентации фосфатидилсерина (ФС) на плазматической мембране для очистки апоптозных клеток.Проапоптотические факторы выделены красными рамками, а антиапоптотические факторы — зеленой рамкой.
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008948.g001
Хотя эти заключительные стадии апоптотической гибели клеток относительно постоянны, существует большая вариативность в том, как воспринимаются различные апоптотические стимулы (см. [15 , 16]). Наиболее изученными механизмами являются внешний и внутренний пути активации (рис. 1). Внешний путь активирует инициаторные каспазы (Casp8 и Casp10) в ответ на активацию «рецепторов смерти» на клетках-мишенях.Напротив, внутренний путь передачи сигналов включает активацию инициатора Casp9 в ответ на множество внутриклеточных стрессов (обзор в [16-18]) и часто включает модуляцию путей передачи сигналов киназ (обзор в [19]). Критическая контрольная точка в этом процессе контролируется белками Bak и Bax, активация и олигомеризация которых приводит к проницаемости внешней мембраны митохондрий. Это запускает высвобождение Cytochrome c (Cyt c) [20-23], который необходим для формирования апоптосомы, и приводит к активации инициатора Casp9 и, следовательно, активации Casp3 / 7 исполнителя (rev. [24]).Активность Bak / Bax строго регулируется рядом конкурирующих про- и антиапоптотических факторов из семейства белков Bcl-2. В здоровых клетках антиапоптотические белки Bcl-2 (например, Bcl-2, Bcl-x L , Mcl-1) ингибируют активацию Bak / Bax [25–27]. Активность этих антиапоптотических факторов, в свою очередь, регулируется белками, содержащими только Bh4 (проапоптотическое подмножество семейства Bcl-2), которые действуют как цитозольные сенсоры клеточного стресса. В ответ на активацию они либо непосредственно активируют Bak / Bax, либо противодействуют активности антиапоптотических белков Bcl-2.Активация / инактивация различных белков, содержащих только Bh4, сложна и контролируется рядом различных механизмов, включая 1) регуляцию уровней экспрессии белков (например, Puma, Noxa, Bim, Bik, Hrk), 2) секвестрацию в интактных сетях цитоскелета. (например, Bim, Bmf), 3) протеолитическое расщепление (например, Bid) и 4) статус фосфорилирования (например, Bad). В конечном итоге именно это взаимодействие между про- и антиапоптотическими членами семейства Bcl-2 регулирует проницаемость митохондрий и, таким образом, индукцию гибели клеток посредством внутреннего пути апоптоза (обзор в [25, 28, 29]).
На сегодняшний день ограниченные исследований in vitro показали, что аренавирусы OW в значительной степени избегают активации апоптоза во время инфекции независимо от вирулентности [30, 31]; хотя есть некоторые признаки апоптоза in vivo в нейробластах и гепатоцитах мышей, инфицированных вирусом лимфоцитарного хориоменингита (LCMV) [32, 33]. Хотя данные о патологии аренавирусов NW ограничены, in vivo свидетельств апоптоза были обнаружены у морских свинок, инфицированных вирусом Pichinde (PICV) [34], инфицированных вирусом Pirital хомяков [35] и макак, инфицированных вирусом Мачупо [36]. .Кроме того, недавно было показано, что высокопатогенный аренавирус NW JUNV не вызывает апоптоз во время инфекции in vitro [37, 38], тогда как близкородственный, но апатогенный TCRV запускает каспазозависимый апоптоз, активируя расщепление Casp9 и Casp3 на поздних стадиях. стадии заражения [39]. Интересно, что недавно сообщалось об апоптозе клеток, инфицированных аттенуированным вакцинным штаммом JUNV (Candid # 1) [40–42], что дополнительно подчеркивает возможное значение этого процесса в патогенезе аренавирусов NW.Однако, хотя различия в исходе на уровне клеточной судьбы наблюдались в этих различных экспериментальных контекстах, почти ничего не известно о клеточных факторах, которые играют роль в регуляции этого процесса. В результате возможная молекулярная основа, лежащая в основе очевидной связи между апоптозом и патогенезом, остается загадочной.
В качестве первого шага к лучшему пониманию регуляции апоптоза во время аренавирусной инфекции на клеточном уровне мы, таким образом, стремились прояснить несколько аспектов сложного взаимодействия между инфекцией TCRV и апоптотическим аппаратом.После подтверждения того, что индуцированный TCRV апоптоз затрагивает митохондрии и протекает по внутреннему пути, мы дополнительно исследовали регуляцию ряда про- и антиапоптотических белков Bcl-2 в ответ на инфекцию. В частности, мы выявили изменения в регуляции белков Bad, Noxa и Puma, содержащих только Bh4, а также фактора транскрипции p53 как в клетках Vero, так и в первичных моноцитах человека, и эти данные теперь позволяют нам предложить модель регуляции. про- и антиапоптотического баланса во время инфекции TCRV.Интересно, что инфекция JUNV также выявила повышенную регуляцию p53 и Puma, таким образом поддерживая модель инфекции JUNV, в которой происходит проапоптотическая передача сигналов, но детектируемое расщепление каспазы (и, как следствие, гибель клеток) активно ингибируется на поздней стадии апоптотического каскада.
Результаты и обсуждение
Апоптоз, индуцированный TCRV, демонстрирует канонические особенности внутреннего пути апоптоза
TCRV-инфекция, как ранее было показано, активирует связанные с апоптозом каспазы в различных типах клеток, при этом задействованные каспазы предполагают активацию через внутренний путь апоптоза (т.е. Casp3 и Casp9, но не Casp8) [39]. Однако доказательства для многих канонических стадий, связанных с внутренним апоптозом (рис. 2A), и особенно с вовлечением митохондрий, отсутствуют. В самом деле, альтернативные митохондриально-независимые механизмы активации Casp9 также были описаны и, в частности, могут быть связаны со стрессом ER [43], который, как предполагалось, играет роль в индукции апоптоза ослабленным штаммом JUNV Candid # 1 [ 41, 44]. Следовательно, было сочтено необходимым сначала лучше определить путь, ответственный за TCRV-опосредованную гибель апоптотических клеток, прежде чем приступить к идентификации конкретных факторов, участвующих в его регуляции.
Рис. 2. Инфекция TCRV вызывает классические признаки внутреннего апоптотического пути.
(A) Схематическая модель ключевых процессов внутреннего апоптоза. Канонические события, связанные с внутренним апоптозом, включают дезорганизацию митохондрий и разрушение мембран, приводящие к высвобождению цитохрома c (Cyt c), активации каспазы (Casp) (особенно Casp9 и Casp3), переворачиванию фосфатидилсерина (PS) и, наконец, гибели клеток (B) активность каспазы . Клетки Vero76 были ложно инфицированы или инфицированы (MOI = 2) TCRV / УФ-инактивированным вирусом в течение 1–4 дней, как указано.Обработка CPT (10 мкМ) в течение 24 ч служила положительным контролем (Ctrl инд.). Лизаты клеток анализировали с помощью вестерн-блоттинга на предмет инициатора Casp8 и Casp9, а также исполнителя Casp3, используя антитела, обнаруживающие как полноразмерную форму (Casp), так и продукты расщепления (cCasp) соответствующих белков. Обнаружение вирусных NP служило контролем для заражения. (C) PS листать. Клетки, инфицированные, как указано выше, окрашивали аннексином V-FITC и PI и анализировали проточной цитометрией. Типичные точечные графики показывают процент положительных по аннексину V (ранние апоптотические клетки), PI-положительных (некротические клетки) и двойных положительных по аннексину V / PI клеток (поздние апоптотические и мертвые клетки).Обработка STS (1 мкМ) в течение 24 ч служила положительным контролем (Ctrl инд.). Репрезентативные изображения морфологии клеток в светлом поле делались каждый день и показаны с масштабными полосами 100 мкм. Количественные оценки воздействия PS представлены в виде средних значений и стандартных отклонений, представляющих данные двух независимых экспериментов. Статистическую значимость определяли с помощью двустороннего дисперсионного анализа (** p≤0,01, нс не значимо).
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008948.g002
Мы действительно смогли подтвердить заметное расщепление инициатора Casp9 и исполнителя Casp3, но не Casp8 в ответ на инфекцию TCRV.Расщепление Casp9 и Casp3 стало видимым через 2 дня после инфицирования, увеличивалось в ходе инфекции (фиг. 2B) и хорошо соответствовало развитию цитопатического эффекта (CPE) на поздних стадиях инфицирования (фиг. 2C). Для сравнения, клетки, обработанные УФ-инактивированным вирусом, не показали расщепления этими факторами, подтверждая, что индукция апоптоза в ответ на TCRV зависит от продуктивной вирусной инфекции. В этом контексте было показано, что сверхэкспрессия только белка Z TCRV может индуцировать расщепление Casp3 [39], но точный механизм (ы), с помощью которого это происходит, и отражает ли это механизм, управляющий индукцией апоптоза во время инфекция еще предстоит расследовать.Тем не менее, наблюдение, что апоптотическая активация, по-видимому, происходит в некоторых экспериментах только после того, как установлена стойкая инфекция, на что указывает накопление NP, может подтверждать роль Z как движущей силы этого процесса, что согласуется с тем фактом, что Z является антисмысловой транскрипт и, следовательно, продуцируется только на поздних стадиях инфицирования. Однако следует проявлять осторожность при проведении таких временных сравнений между различными антигенами на основе вестерн-блоттинга, поскольку антигены могут иметь совершенно разные уровни экспрессии, а их обнаружение зависит от использования разных антител с разной чувствительностью.
Используя окрашивание аннексином V, мы также смогли показать, что воздействие PS на TCRV-инфицированные клетки заметно увеличивалось в ходе инфекции, при этом около 35% общей популяции живых клеток были положительными на аннексин V на 3 и 4 дни после инфицирования (рис. ). Также наблюдался переход от раннего к позднему апоптотическому состоянию, о чем свидетельствует увеличение количества дважды положительных клеток пропидия иодида (PI) / аннексина V, составляющих еще 10–20% от общей популяции живых клеток, в более поздние моменты времени. Также временные рамки этих событий соответствовали развитию CPE.
Наконец, поскольку Casp9 классически активируется в ответ на высвобождение Cyt c из проницаемых митохондрий, мы также специально исследовали инфицированные клетки для доказательства этого процесса. В то время как клетки, подвергнутые ложной обработке, показали дискретную локализацию Cyt c в митохондриях, которые сформировали хорошо организованные митохондриальные сети, инфекция TCRV привела к подмножеству клеток, которые четко показали диффузное окрашивание Cyt c по всей клетке, в том числе и в ядре. как дезорганизация и агрегация митохондрий (рис. 3А).Действительно, хотя некоторые клетки действительно кажутся инфицированными без признаков высвобождения Cyt c, это, вероятно, указывает на то, что инфекция протекает с разной скоростью в этих отдельных клетках, и количественная оценка ясно показывает увеличение процента клеток, демонстрирующих высвобождение Cyt c в цитоплазма либо после лечения CPT, либо в ответ на инфекцию TCRV (рис. 3B).
Рис. 3. Нарушение митохондриальных сетей и высвобождение цитохрома с в клетках, инфицированных TCRV.
(A) Дезорганизация митохондрий и локализация цитохрома с. Клетки Vero76, трансфицированные слитым с GFP вариантом Cyt c (зеленый) и либо инфицированные TCRV в течение 3 дней, либо обработанные 10 мкМ CPT в течение 24 часов перед окрашиванием MitotrackerRed (красный). Локализацию NP (пурпурный) определяли с использованием антитела морской свинки против TCRV NP в качестве инфекционного контроля, и ядра контрастировали с DAPI (синий). Стрелки указывают на дезорганизацию / распад митохондрий. На линейчатой шкале показаны расстояния 10 мкм. (B) Количественная оценка высвобождения Cyt c. Локализацию Cyt c анализировали для каждого лечения (т.е.е. фиктивные, обработанные CPT или инфицированные TCRV) на основе минимум 200 трансфицированных клеток из случайно выбранных полей из двух независимых экспериментов. Локализация была классифицирована как цитозольная (зеленый) или митохондриальная (красный) и показана как процент клеток с каждым фенотипом.
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008948.g003
В совокупности эти данные показывают, что апоптоз, индуцированный TCRV, происходит на поздних стадиях инфекции и протекает преимущественно по внутреннему пути апоптоза каноническим образом, что включает нарушение регуляции митохондриальной сети и высвобождение Cyt c, что приводит к активации каспаз 9 и 3 и воздействию PS.
TCRV вызывает активацию сенсоров, содержащих только Bh4 Puma & Noxa
Регулирование проницаемости митохондрий представляет собой критическую контрольную точку для индукции внутреннего апоптоза. Однако механистическое понимание этого процесса и вовлеченных факторов осложняется тем фактом, что он включает в себя интеграцию входных данных от широкого диапазона конкурирующих про- и антиапоптотических членов семейства Bcl-2 (рис. 4A), которые сами регулируются разнообразие уровней, включая экспрессию, состояние фосфорилирования, протеолитическую активацию и олигомеризацию (см. обзор [25, 45]).
Рис. 4. TCRV влияет на про- и антиапоптотические регуляторы на уровень транскрипта мРНК и белка.
(A) Схематическая модель факторов клетки-хозяина, участвующих в регуляции проницаемости митохондрий. Проапоптотические сенсоры Bh4 могут либо непосредственно активировать Bak и Bax (оба выделены красными рамками), либо противодействовать их ингибиторам, антиапоптотическим белкам Bcl-2 (показаны зеленым). (B) Уровни транскриптов про- и антиапоптотических регуляторов апоптоза.Инфекцию TCRV проводили в клетках Vero76 при MOI, равном 2, и каждый день собирали образцы для экстракции РНК. Уровни экспрессии мРНК определяли с помощью RT-qPCR с наборами специфичных для генов праймеров (таблица S1) от 0 до 4 точек на дюйм, как указано. Уровни GAPDH использовали для стандартизации, и кратное изменение уровней мРНК TCRV-инфицированных клеток (по сравнению с ложно-инфицированными клетками) рассчитывали с использованием метода 2 -ΔΔCt . Показаны средние значения и стандартные отклонения по крайней мере трех независимых экспериментов. (C) Уровни белков выбранных про- и антиапоптотических регуляторов апоптоза. Клетки Vero76 инфицировали, как указано выше, и лизаты подвергали вестерн-блоттингу с антителами, специфичными для Puma α / β, Puma α, Noxa, Bmf, Bim, Bcl-2 или Bak, как указано. Поддельные клетки служили отрицательным контролем, тогда как клетки, обработанные СРТ (10 мкМ), служили положительным контролем (Ctrl инд.). Окрашивание на винкулин или α-тубулин использовали для контроля загрузки. Вестерн-блоттинг оценивали путем измерения интенсивности пикселей для полос белка с нормализацией к соответствующему контролю загрузки.Количественные оценки представлены как средние значения и стандартные отклонения по крайней мере двух независимых экспериментов. Статистическую значимость определяли с помощью двухфакторного дисперсионного анализа (* p≤0,05, **** p≤0,0001, нс не значимо).
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008948.g004
Чтобы получить представление о факторах, которые могут быть задействованы в регуляции апоптоза, индуцированного TCRV, мы сначала исследовали уровни экспрессии различных про- и антиапоптотические члены семейства Bcl-2 с использованием RT-qPCR (фиг. 4B).Поразительно, что уровни мРНК для Puma (проапоптотический белок, содержащий только Bh4) показали заметно увеличенную экспрессию почти в 10 раз при 2 dpi. Другие проапоптотические сенсорные гены Bh4, такие как Noxa, Bmf и Hrk, показали более умеренные уровни активации мРНК (примерно в 5 раз), тогда как наблюдалась незначительная модуляция уровней мРНК Bid, Bim, Bik и Bad. Интересно, что уровни мРНК проапоптотического фактора Bak постепенно снижались во время инфекции, достигая 5-кратного снижения при 4 dpi.Напротив, экспрессия Bax, которая играет во многом аналогичную проапоптотическую роль, не пострадала. Среди антиапоптотических белков Bcl-2 экспрессия мРНК для Bcl-w, Mcl-1 и Bcl-x L оставалась неизменной, в то время как уровни Bcl-2 были умеренно подавлены.
Чтобы определить, транслируются ли эти изменения в уровнях мРНК в значимые изменения экспрессии белка, мы затем исследовали уровни белка для этих факторов с помощью Вестерн-блот-анализа. В соответствии с данными RT-qPCR, белки, содержащие только Bh4, Puma (α- и β-изоформы) и Noxa показали повышенную экспрессию белка и накапливались в ходе инфекции (рис. 4C).Повышающая регуляция этих белков в качестве проапоптотического стимула в контексте инфекции TCRV будет соответствовать существующим моделям активации этих факторов, в соответствии с которыми их активность в первую очередь регулируется уровнями их экспрессии, которая, в свою очередь, контролируется на уровне мРНК. синтез. В частности, повышенное количество этих белков регулирует апоптозный баланс либо 1) связыванием антиапоптотических белков Bcl-2 для предотвращения их ингибирующей ассоциации с Bak и Bax, либо 2) связыванием «дерепрессора» (например.грамм. Noxa) к антиапоптотическим белкам Bcl-2, чтобы предотвратить их ингибирующую ассоциацию с «прямыми активаторами» (например, Puma), которые затем становятся доступными для индукции апоптоза через их ассоциацию с Bak и Bax (обзор [25–27]). Таким образом, усиление активности этих факторов как на уровне мРНК, так и на уровне белка убедительно свидетельствует об их участии в апоптозе, опосредованном TCRV.
В отличие от данных по экспрессии мРНК, показывающих умеренно повышенную экспрессию при 4 dpi, Bmf, другой проапоптотический белок, содержащий только Bh4, продемонстрировал снижение стационарных уровней белка в клетках, инфицированных TCRV (рис. 4C).Таким образом, похоже, что другие механизмы, например репрессия трансляции или повышенный оборот белка могут играть более значительную роль в регулировании уровней Bmf во время инфекции TCRV. Повышенная экспрессия мРНК в поздние моменты времени может указывать на попытку клетки саморегулировать этот дефицит. Хотя изначально нелогично видеть высокие уровни экспрессии типично проапоптотического белка Bh4 в здоровых (ложно-инфицированных) клетках, это, вероятно, объясняется основным механизмом регуляции Bmf, посредством которого он обычно изолируется в неактивном состоянии посредством актиновый цитоскелет, но при разрушении цитоскелета высвобождается, что способствует апоптозу [46].В самом деле, подобная высокая базальная экспрессия наблюдалась в др. Контекстах для проапоптотических белков, которые обнаруживают секвестрацию цитоскелета [47]. Интересно, что это предполагает, что пониженные уровни Bmf, наблюдаемые в клетках, инфицированных TCRV, могут придавать определенную степень устойчивости к апоптотическим стимулам, связанным с разрушением актинового цитоскелета. Похожий механизм действия используется только Bh4-белком Bim, который секвестрируется в филаменты тубулина [45]; однако мы не наблюдали изменений ни в мРНК, ни в уровнях экспрессии белка Bim, предполагая, что он не может играть роль в апоптозе в ответ на TCRV-инфекцию.
К сожалению, для Hrk, другого белка, содержащего только Bh4, экспрессия мРНК которого предполагает повышенную экспрессию, мы не смогли подтвердить экспрессию белка, поскольку эндогенные уровни этого фактора не могли быть обнаружены в экспериментальных условиях с использованием доступных антител. То же самое верно и для Bik, хотя в этом случае экспрессия мРНК указывает на отсутствие изменений транскрипции.
В отличие от некоторых проапоптотических белков, содержащих только Bh4, оказалось, что инфекция оказывает незначительное влияние на уровни антиапоптотических белков Bcl-2 или Bak и Bax, при этом в большинстве случаев не наблюдается изменений на уровне транскрипции, а умеренные изменения, предложенные для Bcl-2 и Bak, не соответствующие изменениям на уровне белка (рис. 4C).Таким образом, похоже, что сдвиг проапоптотического / антиапоптотического баланса во время инфекции TCRV зависит в первую очередь от модуляции уровней экспрессии проапоптотического белка Bh4, в частности, Puma и Noxa, а не от изменений в количестве анти-антибиотиков. апоптотические белки Bcl-2 или Bak и Bax.
p53 активируется и подвергается ядерной транслокации во время инфекции TCRV
Учитывая, что мы наблюдали активацию транскрипции только Bh4-белков Puma и Noxa, мы также стремились продемонстрировать активацию p53, первичного фактора транскрипции, ответственного за экспрессию этих факторов.В здоровых клетках белок-супрессор опухолей р53 постоянно разрушается убиквитин-протеасомным путем в процессе, опосредованном связыванием MDM2. Однако стресс может индуцировать фосфорилирование p53 во многих сайтах, что приводит к снижению связывания MDM2 и стабилизации p53, который затем накапливается в ядре, где он транскрипционно активирует ряд генов, включая Puma и Noxa [48-50]. В соответствии с этим механизмом активации, мы не наблюдали изменений в уровнях мРНК p53 во время TCRV-инфекции (рис. 5A), но наблюдали сильное увеличение уровней общего белка p53 при 3 и 4 dpi (рис. 5B), что свидетельствует о стабилизации. белка, а не увеличил синтез de novo p53.Чтобы получить более полное представление о функциональных последствиях наблюдаемого повышения уровня p53, мы проанализировали локализацию этого фактора транскрипции с помощью иммунофлуоресцентного анализа (IFA). Здесь мы снова наблюдали повышенную экспрессию p53, а также сильное накопление этого белка в ядрах инфицированных клеток (рис. 5C). Некоторые клетки, демонстрирующие транслокацию p53, также показали аномальную структурную морфологию клеточных компартментов (то есть дезорганизацию митохондрий и ядерную конденсацию), что указывает на то, что они находились на более поздних стадиях гибели клеток.Мы наблюдали аналогичные изменения, когда апоптоз индуцировали с помощью CPT, что также приводит к сверхэкспрессии белков, регулируемых p53, таких как Puma и Noxa (сравните с контрольной индукцией для этих генов на фиг. 4). Кроме того, мы могли напрямую продемонстрировать роль p53 в облегчении экспрессии Puma и Noxa с помощью ингибитора p53 (пифитрин-α; PFT-α), обработка которого увеличивающимися концентрациями отменяла транскрипцию обоих этих факторов (рис. 5D). Это согласуется с тем фактом, что p53 хорошо документирован как основной фактор транскрипции для этих генов в ответ на большинство видов стимулов, в то время как Puma и Noxa, в свою очередь, несут ответственность за большую часть апоптотической функции p53 во многих контекстах ( рассмотрен в [51]).
Рис. 5. Экспрессия белка, фосфорилирование и ядерная транслокация p53 в TCRV-инфицированных клетках.
(A) Уровни транскрипта p53 . Инфекцию TCRV проводили в клетках Vero76 при MOI, равном 2, и каждый день собирали образцы для экстракции РНК. Экспрессию p53 количественно оценивали с помощью RT-qPCR с набором специфичных для генов праймеров (таблица S1) в указанные моменты времени между 0–4 днями после инфицирования (dpi). Уровни GAPDH использовали для стандартизации, и кратное изменение уровней мРНК TCRV-инфицированных клеток (по сравнению с ложно-инфицированными клетками) рассчитывали с использованием метода 2 -ΔΔCt .Значения представляют собой средние значения и стандартные отклонения от трех независимых повторов. (B) Уровни экспрессии белка и фосфорилирование p53 . Лизаты клеток, инфицированных TCRV, с разрешением от 1 до 4 точек на дюйм анализировали вестерн-блоттингом на общую экспрессию p53, а также на фосфорилирование по Ser15 или Ser392 соответствующими антителами. Винкулин служил контролем загрузки. Поддельные клетки служили отрицательным контролем, тогда как обработка CPT (10 мкМ) использовалась в качестве положительного контроля (Ctrl инд.).Стрелка указывает на неидентифицированную полосу перекрестной реакции, которая также обнаруживается с антителом против p53. Вестерн-блоты оценивали путем измерения интенсивности пикселей с нормализацией к соответствующему контролю загрузки. Количественные оценки основаны как минимум на двух независимых экспериментах. Статистическая значимость определялась с использованием двустороннего дисперсионного анализа (* p≤0,05, ** p≤0,01, нс не значимо). (C) ядерная транслокация p53. Митохондрии окрашивали 3 dpi TCRV с использованием MitotrackerRed (красный), затем окрашивали антителами с использованием анти-p53 (зеленый) и анти-TCRV NP (пурпурный) и мечения ядер DAPI (синий).Поддельные клетки служили отрицательным контролем, тогда как обработка CPT (10 мкМ) использовалась в качестве положительного контроля (Ctrl инд.). Стрелки указывают на морфологические изменения, соответствующие клеткам на поздних стадиях апоптоза. Шкала показывает расстояние 10 мкм. (D) Влияние ингибирования p53 на экспрессию Puma и Noxa. Клетки Vero76 обрабатывали ежедневно PFT-α (3, 10 и 30 мкМ) или только ДМСО и либо Mock-, либо TCRV-инфицированными (MOI = 1). Клеточные лизаты собирали с разрешением 4 dpi и анализировали на экспрессию Puma и Noxa с помощью вестерн-блоттинга, в то время как винкулин служил контролем загрузки.Экспрессия Puma и Noxa была количественно определена на основе двух независимых экспериментов и нормализована к соответствующему контролю нагрузки. Статистическую значимость определяли с помощью двустороннего дисперсионного анализа (** p≤0,01, *** p≤0,001, нс не значимо).
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008948.g005
Как отмечалось выше, стабильность и активность p53 регулируются на основе сложного паттерна посттрансляционных модификаций и, в частности, ряда сайтов фосфорилирования. известно, что они важны для его апоптотической активности (см. обзор [52, 53]).Чтобы получить представление о посттрансляционных модификациях, связанных с активацией p53 в контексте инфекции TCRV, мы использовали коммерчески доступные антитела для оценки состояния его фосфорилирования. Интересно, что мы не наблюдали фосфорилирования p53 по Ser15 в TCRV-инфицированных клетках; однако C-концевой серин в положении 392 обнаруживает четкие доказательства фосфорилирования при 4 dpi (фиг. 5B). Хотя было показано, что фосфорилирование по Ser15 необходимо для активации транскрипции с помощью p53, это, по-видимому, требует только базальных уровней модификации и не обязательно индуцируется в ответ на любой данный апоптотический стимул [54], как, по-видимому, также имеет место для TCRV -индуцированная активация p53.Однако одной модификации Ser392 может быть недостаточно, чтобы объяснить сильное ядерное накопление p53, наблюдаемое во время TCRV-индуцированного апоптоза, поскольку фосфо-Ser392 p53, как сообщается, только слабо транслоцируется по сравнению с другими фосфорилированными формами p53 [55]. Таким образом, это указывает на то, что другие модификации, вносящие вклад в стабилизацию p53 и ядерную локализацию, еще предстоит идентифицировать. Кроме того, наблюдение, что Ser392 p53 наблюдается только очень поздно по сравнению с позитивной регуляцией генов-мишеней p53 Puma и Noxa, также может подтверждать более доминирующую роль другой модификации в активации p53, хотя опять же требуется осторожность при проведении временных сравнений между различными антигены.Тем не менее, взятые вместе эти результаты подтверждают, что TCRV запускает модификацию p53, включая фосфорилирование по Ser392, что приводит к накоплению p53 и его рекрутированию в ядро, где он активирует транскрипцию подмножества генов, которое включает Puma и Noxa.
Датчик Bad, содержащий только Bh4, накапливается в неактивной фосфорилированной форме
В отличие от большинства других белков, содержащих только Bh4, связанных с внутренним апоптозом, которые в первую очередь регулируются экспрессией и / или секвестрацией, проапоптотическая активность Bad в первую очередь регулируется фосфорилированием.Фосфорилирование Bad приводит к его секвестрации и инактивации с помощью 14-3-3, тем самым предотвращая его взаимодействие с антиапоптотическими белками Bcl-2 и Bcl-x L и их ингибирование (рис. 6A). . Во время инфекции TCRV Bad не показал изменений в уровне экспрессии мРНК по сравнению с ложными клетками (рис. 4B), и это было подтверждено вестерн-блоттингом уровней экспрессии общего белка (рис. 6B). Однако наблюдалось сильное повышение уровней Bad, фосфорилированного по Ser112, который является неактивной формой белка.Накопление определяемых уровней фосфо-Бад происходило уже на 2 dpi и увеличивалось до 4 dpi (рис. 6B). Наблюдение за тем, что Bad накапливается в фосфорилированной и инактивированной форме во время инфекции TCRV, предполагает, что этот фактор может участвовать в замедлении индукции апоптоза, противодействуя другим идентифицированным проапоптотическим факторам (например, Puma и Noxa), что, возможно, помогает объяснить, почему гибель клеток во время инфекции TCRV происходит только в сравнительно поздние сроки. Интересно, что участие Bad фосфорилирования в аренавирусной регуляции апоптоза также предполагает ассоциацию киназных сигнальных путей, некоторые из которых, как сообщается, активируются в ответ на аренавирусную инфекцию [59–68].В частности, в некоторых случаях было показано, что плохое фосфорилирование по Ser112 зависит от ERK-зависимой киназы p90-RSK [69–71], и действительно, путь ERK необходим для эффективной вирусной репликации JUNV, TCRV и PICV [59, 60, 64, 68]. Однако другие киназы, такие как протеинкиназа А, также могут опосредовать модификацию этого сайта [72]. Таким образом, эта тема явно требует дальнейшего подробного исследования, чтобы установить возможную роль различных киназ и связанных с ними сигнальных путей в регуляции Bad (а также p53) в ответ на инфекцию TCRV.
Рис. 6. Инфекция TCRV вызывает фосфорилирование Bh4-сенсора Bad.
(A) Схематическая модель управляемой фосфорилированием регуляции активности Bad. В своей активной нефосфорилированной форме проапоптотический белок Bh4-only Bad (выделен красным прямоугольником) способен взаимодействовать с антиапоптотическими белками Bcl-2 (показаны зеленым), чтобы снять их репрессию Bak и Bax. . Однако в своем фосфорилированном состоянии Bad блокируется 14-3-3, ингибируя его проапоптотическую активность. (B) Уровни белка и фосфорилирование Bad. TCRV-инфицированных и ложно-инфицированных лизатов клеток Vero76 исследовали в указанные временные точки 1–4 dpi для определения общего Bad, а также фосфорилирования по Ser112 с помощью специфических антител. Поддельные клетки служили отрицательным контролем, тогда как обработка CPT (10 мкМ) использовалась в качестве положительного контроля (Ctrl инд.). Окрашивание на α-тубулин использовали в качестве контроля загрузки. Вестерн-блоттинг оценивали путем измерения интенсивности пикселей и нормализации к соответствующим контрольным показателям загрузки.Количественные оценки представлены как средние значения и стандартные отклонения по крайней мере двух независимых экспериментов. Статистическую значимость определяли с помощью двустороннего дисперсионного анализа (** p≤0,01, **** p≤0,0001, нс не значимо).
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008948.g006
Bad, p53, Noxa и Puma также регулируются в первичных моноцитах человека
В то время как наши первоначальные механистические исследования апоптоза, индуцированного TCRV, были сосредоточены на клетках Vero в качестве полезной модели, которая показывает устойчивый рост вируса и для которой многие анализы хорошо установлены, мы ранее показали, что инфекция TCRV может активировать апоптоз в различных клетках. типы [39].Однако, хотя пути апоптоза высоко консервативны, использование клеточных линий для изучения конкретных механизмов апоптоза по-прежнему сопряжено с определенными рисками из-за возможности изменений экспрессии или регуляции факторов, важных в этих путях. Кроме того, из-за делеции в соответствующем кластере генов известно, что клетки Vero испытывают дефицит продукции интерферона I типа [73, 74], что также может способствовать индукции апоптоза в некоторых случаях [75]. Таким образом, мы стремились подтвердить наши ключевые результаты в отношении первичных моноцитов человека, как биологически значимого первичного типа клеток для аренавирусной инфекции.Для этой цели моноциты культивировали из мононуклеарных клеток периферической крови, выделенных из крови человека и охарактеризованных с помощью проточной цитометрии на экспрессию CD14, чтобы подтвердить их идентичность перед использованием в экспериментах (фиг. 7A). В то время как TCRV не продуцировал очевидного CPE во время инфицирования моноцитов (фиг. 7B), клетки были продуктивно инфицированы и показали расщепление инициатора Casp9 и палача Casp3 (фиг. 7C). Кроме того, мы обнаружили паттерн активации фактора только Bh4, аналогичный паттерну, идентифицированному в клетках Vero76.В частности, как и ожидалось, мы наблюдали повышенные уровни p53, Puma и Noxa. Интересно, однако, что экспрессия общего Bad, по-видимому, была более значительно увеличена в TCRV-инфицированных моноцитах (рис. 7C). В самом деле, это обеспечивает механистическую поддержку нашего предыдущего наблюдения, что моноцитарные клетки особенно восприимчивы к TCRV-индуцированному апоптозу [39], так как ожидается, что эти повышенные уровни Bad обеспечат дополнительный проапоптотический стимул. В целом, эти данные позволяют предположить, что выявленные факторы, содержащие только Bh4 (т.е. Puma, Noxa и Bad) важны для регуляции апоптоза, индуцированного TCRV, как в первичных, так и в иммортализованных клетках, и их участие не зависит от продукции интерферона. Тем не менее, эти данные также указывают на то, что между типами клеток могут быть тонкие различия в степени индукции и / или модификации этих факторов, что может затем повлиять на восприимчивость этих типов клеток к апоптозу, индуцированному TCRV.
Рис. 7. Регулирование факторов апоптоза в первичных моноцитах человека, инфицированных TCRV.
(A) Окрашивание выделенных первичных клеток человека на CD14. Первичные культуры моноцитов человека окрашивали антителом к CD14-PE и анализировали проточной цитометрией. Типичные точечные графики показывают процент CD14-положительных клеток. (B) Морфология моноцитов, инфицированных TCRV. Яркие полевые изображения имитированных и TCRV-инфицированных первичных культур моноцитов были получены с разрешением 4 точки на дюйм и показаны с масштабными полосами 100 мкм. (C) Уровни белков ключевых факторов апоптоза в моноцитах, инфицированных TCRV. Первичные клетки были инфицированы TCRV и ложно инфицированы, а лизаты клеток проанализированы с помощью вестерн-блоттинга при 4 dpi на полноразмерные каспазы 3 и 9 (Casp3, Caps9), а также на продукты их расщепления (cCasp3 и cCasp9) в дополнение к p53 , Puma, Noxa, Bad and Bad-P (Ser112). Окрашивание NP служило положительным контролем на инфекцию, а окрашивание на винкулин использовали в качестве контроля нагрузки. Количественные оценки показывают средние значения и стандартные отклонения по крайней мере из двух независимых экспериментов с использованием разных доноров крови.Статистическую значимость определяли с помощью двустороннего дисперсионного анализа (** p≤0,01, *** p≤0,001, **** p≤0,0001).
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008948.g007
Нокаут Noxa, Puma и Bad модулируют индукцию апоптоза во время инфекции TCRV
Учитывая, что наши результаты убедительно свидетельствуют о том, что апоптоз, индуцированный TCRV, контролируется, по крайней мере, в некоторой степени, за счет регуляции проапоптотических белков, содержащих только Bh4, Puma, Noxa и Bad, мы хотели напрямую подтвердить их важность в этом процессе.Чтобы облегчить эти исследования, мы создали линии клеток Puma, Noxa и Bad knockout (KO), используя систему CRISPR / Cas9. В то время как контрольные клетки показали определяемые уровни экспрессии белка для всех трех факторов (Bad, Puma и Noxa), анализ клеток KO подтвердил потерю соответствующих белков (фиг. 8A). Индукция апоптоза, как продемонстрировано расщеплением Casp3, была заметно снижена в клетках Puma и Noxa KO как во время лечения CPT, так и во время инфицирования TCRV, хотя уровни расщепления каспазы все еще, по-видимому, достигли уровней дикого типа поздно во время инфицирования в Puma-дефицитных клетках (i .е. 4 точки на дюйм; Рис 8A). Это может быть связано с эффектами других белков, содержащих только Bh4, например Noxa, который может до некоторой степени компенсировать недостаток Puma в этих клетках. Эффект этих KOs также ясно виден при наблюдении за морфологией клеток, где KO либо Puma, либо Noxa приводили к резкому снижению CPE (Рис. 8B). Взятые вместе, эти данные подтверждают роль Puma и Noxa как ключевых игроков, участвующих в продвижении апоптоза, индуцированного TCRV. С другой стороны, нокаут Bad приводит к повышенной апоптотической активности во время инфекции TCRV (фиг. 8A), что совпадает с явными видимыми признаками гибели клеток (фиг. 8B).Хотя было удивительно, что потеря проапоптотического фактора, который накапливается в его неактивной форме в ответ на инфекцию, будет иметь проапоптотический эффект, это наблюдение можно объяснить изменениями в доступности 14-3-3. Как уже упоминалось, Bad-P неактивен из-за его секвестрации 14-3-3 [56-58]; таким образом, полное отсутствие Bad / Bad-P в нашем подходе KO, как ожидается, устранит это связывание и увеличит количество несвязанного 14-3-3 в клетке. Несвязанный 14-3-3 затем будет доступен для участия в других регуляторных взаимодействиях, включая повышение стабильности / активности p53 за счет связывания с его негативным регулятором MDMX (рассмотрено в [76]), который затем будет оказывать проапоптотический эффект.Таким образом, эти данные также подтверждают роль накопления неактивного фосфо-Bad как важного ингибирующего процесса, который противодействует проапоптотическим сигналам, генерируемым в ответ на инфекцию TCRV.
Рис. 8. Влияние Puma, Noxa и Bad knockout (KO) на апоптоз, индуцированный TCRV.
(A) Экспрессия белка Bh4 и расщепление каспазой в клетках KO, инфицированных TCRV. KO-клетки (+) и контрольные родительские клетки (-) были инфицированы TCRV (MOI 1) или ложно-инфицированы и лизированы от 2 до 4 dpi перед анализом вестерн-блоттингом на Bad, Noxa, Puma, полноразмерную каспазу 3 ( Casp3) или продукт его расщепления (cCasp), как указано, а также винкулин, контролирующий загрузку.Обработку CPT (10 мкМ) использовали в качестве положительного контроля. Интенсивность пикселей полос расщепленного белка Casp3 измеряли и нормализовали к полосам полной длины Casp3. Количественные оценки показывают средние значения и стандартные отклонения по крайней мере из двух независимых экспериментов. Статистическую значимость определяли с помощью двустороннего дисперсионного анализа (** p≤0,01, *** p≤0,001, **** p≤0,0001, нс не значимо). (B) Образование CPE в KO-клетках во время инфекции TCRV. Снимки в светлом поле КО и клеток родительского контроля были сделаны с разрешением 4 точки на дюйм и показаны с масштабными полосами 100 мкм.(C) Рост вируса в клетках Bad, Noxa и Puma KO. Клетки инфицировали TCRV при MOI, равном 1. Супернатанты собирали от 0 до 4 точек на дюйм и титры вирусов определяли с помощью анализа бляшек.
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008948.g008
Интересно, что, несмотря на четкую связь между этими отдельными белками, содержащими только Bh4, и изменениями в активации расщепления каспазы и последующей гибели клеток, нокаут этих отдельных факторов , будь то про- или антиапоптоз, мало влияли на рост вируса in vitro (фиг. 8C).С одной стороны, это может быть связано со способностью этих отдельных нокаутов задерживать, но не предотвращать активацию каспаз. И наоборот, отсутствие влияния апоптоза на репликацию вируса также может быть связано с поздней стадией, на которой происходит апоптоз в ответ на инфекцию TCRV, момент времени, к которому многие вирусные процессы уже завершены и новое вирусное потомство уже эффективно продуцируется. . Таким образом, эти данные предполагают, что регуляция апоптоза с помощью TCRV не может напрямую поддерживать эффективную репликацию и / или высвобождение вируса на уровне отдельных инфицированных клеток, а скорее, что индукция апоптоза взаимосвязана с необходимостью активировать специфические клеточные сигнальные пути (такие как те, которые включают р53 и / или специфические киназы хозяина), чтобы поддерживать ключевые вирусные процессы.В самом деле, это согласуется с растущим объемом данных, показывающих, что аренавирусная инфекция может регулировать и / или зависит от множества путей передачи сигналов киназ [59–68]. Альтернативно, возможно, что прямое участие апоптоза в росте вируса актуально только для определенных типов клеток, например в макрофагах, где мимикрия апоптоза может играть особенно важную роль в качестве механизма захвата и / или контроля воспалительных реакций. В самом деле, это потенциально может быть подтверждено недавними данными, предполагающими роль PS-рецепторов в проникновении ряда различных аренавирусов, включая TCRV [77–80].
Сравнение активации внутренних регуляторов апоптоза во время инфекции TCRV и JUNV
В то время как TCRV явно способен вызывать апоптотическую гибель клеток, мы ранее показали, что высоковирулентный JUNV избегает гибели клеток [39], предположительно благодаря способности JUNV NP служить очень распространенным субстратом-ловушкой для расщепления каспазы [38]. Однако, учитывая сложную сеть факторов, которые могут регулировать внутренний апоптоз, мы до сих пор не смогли экспериментально подтвердить эту модель.Установив механизм, с помощью которого TCRV запускает апоптоз, мы, таким образом, также хотели установить, индуцируются ли подобные проапоптотические ответы в ответ на инфекцию JUNV, как можно было бы предсказать с помощью текущей модели.
В соответствии с нашими предыдущими находками, мы подтвердили, что хотя активация каспаз происходит в ответ на инфекцию TCRV, активация Casp3 в клетках, инфицированных JUNV, отсутствует (рис. 9A) [38, 39]. Кроме того, мы также обнаружили, что JUNV не индуцирует активацию вышестоящего инициатора Casp9, указывая на то, что путь уже заблокирован на этом уровне.Отсутствие этих критических поздних стадий апоптоза во время инфекции JUNV согласуется с отсутствием CPE, наблюдаемым в инфицированных JUNV клетках (фиг. 9B). Интересно, однако, что анализ вышележащих Bh4-факторов, идентифицированных как играющих роль в апоптозе, индуцированном TCRV-инфекцией, показал, что также наблюдается выраженная повышающая регуляция как p53, так и Puma во время JUNV-инфекции. Небольшое увеличение экспрессии Noxa было также отмечено во время инфекции JUNV, хотя это было не так устойчиво, как для TCRV (рис. 9A).Эти результаты предполагают, что и JUNV, и TCRV индуцируют сходные проапоптотические сигнальные события на уровне активации белка Bh4-only. Однако, в отличие от TCRV, на фосфорилирование Bad, по-видимому, не влияет инфекция JUNV (рис. 9A), что указывает на различия в сигнальных событиях, лежащих в основе этого процесса. Тем не менее, наблюдение, что JUNV индуцирует проапоптотическую передачу сигналов, но уклоняется от активации каспазы (и, следовательно, гибели клеток), подтверждает участие тормозного механизма, используемого JUNV для ограничения активности каспаз.В частности, это согласуется с ранее предложенной моделью, в которой NP JUNV, но не NP TCRV, служит субстратом-ловушкой для каспаз [38], чтобы ослаблять расщепление каспаз и ингибировать апоптоз. Это также потенциально обеспечивает интересное понимание ситуации с аттенуированным вакцинным штаммом Candid # 1, который в отличие от вирулентных штаммов JUNV вызывает апоптоз в ответ на инфекцию [41, 42]. Однако, учитывая отсутствие различий в последовательностях NP по сравнению с другими штаммами JUNV [81], можно ожидать, что Candid # 1 будет подвергаться расщеплению NP каспазами.В этом отношении важно отметить, что кандидат № 1, как было показано, вызывает апоптоз в результате несвязанного механизма, который включает индукцию развернутого белкового ответа из-за нарушения созревания GP (в результате мутации, влияющей на гликозилирование) [ 41]. Основываясь на наших данных, которые теперь показывают, что вирулентный JUNV действительно вызывает апоптоз, прежде чем контролировать его посредством расщепления NP, мы предполагаем, что в случае Candid # 1 комбинация этих двух различных проапоптотических сигналов, т.е. Путь UPR может быть достаточным для подавления способности NP конкурировать с природными субстратами каспаз (включая сами каспазы) в этом контексте.
Рис. 9. Регулирование факторов апоптоза во время инфекции TCRV и JUNV.
(A) Уровни белков отдельных факторов апоптоза. Заражение либо TCRV, либо JUNV проводили при MOI 0,1 в клетках Vero76, и клеточные лизаты собирали с 1–4 точек на дюйм. Образцы подвергали вестерн-блоттингу и окрашивали на полноразмерные каспазы (Casp) 3 и 9, продукты их расщепления (cCasp), p53, Puma, Noxa, Bad и Bad-P (Ser112). Окрашивание NP служило положительным контролем на инфекцию, а окрашивание на винкулин использовали в качестве контроля нагрузки.Вестерн-блоттинг оценивали путем измерения интенсивности пикселей с нормализацией к контролю загрузки. Количественные оценки данных, полученные при разрешении 4 точек на дюйм, показаны как средние значения и стандартные отклонения по крайней мере двух независимых экспериментов. Статистическая значимость определялась с использованием двустороннего дисперсионного анализа (* p≤0,05, ** p≤0,01, нс не значимо). (B) Образование CPE в клетках Vero76 во время инфекции TCRV и JUNV. Яркие полевые изображения ложных и инфицированных клеток были сделаны с разрешением 4 точки на дюйм и показаны с масштабными полосами 100 мкм.
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008948.g009
Модель апоптоза, индуцированного TCRV
В целом, растет понимание того, что ряд вирусов разработали стратегии, которые используют апоптотический каскад, чтобы либо уклониться от этого защитного механизма, либо использовать его индукцию для поддержки распространения (обзор в [82, 83]), и наша работа это привело нас к модели процесса, с помощью которого TCRV индуцирует апоптоз в инфицированных клетках (рис. 10).Мы ясно видим, что этот вирус индуцирует апоптоз через внутренний путь апоптоза и что этот процесс связан с классическими особенностями митохондриальной дезорганизации и дисфункции, высвобождения Cyt c, активации инициатора Casp9 и палача Casp3, экстернализации PS, а также ядерной конденсации и возможной гибели клеток. . Кроме того, мы показали, что этот процесс основан на усилении проапоптотических белков Puma и Noxa, которые являются генами-мишенями р53-опосредованной транскрипции.Этой усиленной транскрипции способствует стабилизация и ядерная транслокация р53, которая, по крайней мере, частично связана с фосфорилированием белка в положении Ser392. В то же время, TCRV также, по-видимому, вызывает изменения, которые сдвигают про / антиапоптотический баланс в пользу выживания клеток. Примечательно, что обычно проапоптотический фактор Bad превращается в неактивную форму путем фосфорилирования в положении Ser112. Затем это приводит к секвестрации 14-3-3, что блокирует его способность противодействовать активности антиапоптотических белков Bcl-2 [56], потенциально высвобождая больше этих молекул для борьбы с активностью других проапоптотических белков Bh4- только белки, индуцированные в ответ на инфекцию (т.е. Пума и Нокса). Однако, хотя эти антиапоптотические сигналы могут позволить клетке продлить клеточную выживаемость и функцию, в конечном итоге баланс сил благоприятствует возможной апоптотической гибели клетки на поздних стадиях инфекции.
Рис. 10. Модель регуляции внутреннего пути апоптоза инфекцией TCRV.
Вирус аренавируса Нового Света Tacaribe (TCRV) запускает внутренний апоптотический путь посредством регуляции белков Puma, Noxa и Bad, содержащих только Bh4. Продуктивная инфекция TCRV запускает пока неизвестный фактор / процесс хозяина, который приводит к стабилизации и, таким образом, к увеличению внутриклеточных уровней p53, сопровождаемых фосфорилированием по Ser392.Это приводит к ядерной транслокации p53, которая затем стимулирует активацию транскрипции только Bh4-белков Puma и Noxa. Затем они связываются со своими антагонистами, антиапоптотическими белками Bcl-2, чтобы облегчить их ингибирование Bak и Bax и / или непосредственно активировать Bak и Bax. В то же время активация неидентифицированной киназы инфекцией TCRV приводит к фосфорилированию Bad по Ser112. Это подавляет апоптотическую активность Bad, способствуя его связыванию с 14-3-3 для предотвращения его антагонистической ассоциации с антиапоптотическими белками Bcl-2.В то время как эффект плохого фосфорилирования, по-видимому, уравновешивает проапоптотические эффекты Puma и Noxa и может задерживать гибель клеток, проапоптотические стимулы в конечном итоге преобладают и приводят к проницаемости внешней мембраны митохондрий, с соответствующим высвобождением Cyt c, что приводит к активации расщепления (cCasp) инициаторной каспазы 9 и исполнительной каспазы 3, которые затем опосредуют апоптотические события, такие как переворот PS, ядерная конденсация и гибель клеток.
https://doi.org/10.1371 / journal.ppat.1008948.g010
Интересно, что отсутствие какого-либо прямого воздействия апоптоза на репликацию вируса и / или высвобождение потомства вируса на уровне отдельных инфицированных клеток предполагает более сложную основу для связи между апоптозом и патогенезом . Теперь это требует, чтобы мы также рассмотрели процессы, которые недостаточно хорошо представлены в стандартных системах инфицирования культур клеток in vitro . В частности, явно необходима более детальная оценка роли вирусосодержащих апоптотических тел, богатых PS, а также влияния апоптозного воздействия PS на липидный состав вирусных частиц.Можно ожидать, что такие факторы будут влиять на распознавание / поглощение этих продуктов фагоцитами и могут иметь значительные последствия для активации противовирусных иммунных ответов в этих клетках, которые, как уже было показано, заметно различаются между патогенными и апатогенными аренавирусными инфекциями [30, 84– 86]. Далее, интересно рассмотреть, как эти наблюдения могут быть переведены на регуляцию клеточной судьбы у естественных видов хозяев этих вирусов, которыми для JUNV являются мыши Calomys spp .(в частности, Calomys musculinus ) [6, 87], а для TCRV в настоящее время предполагается, что это Artibeus spp . летучие мыши [88]. Действительно, исходя из очевидной связи индукции апоптоза с патогенезом в контексте человека, можно ожидать различий в том, как данный вирус регулируется в клетках человека и клеток этих видов хозяев. В этом контексте TCRV на самом деле представляет собой особенно интересный случай, поскольку, хотя он обычно не вызывает серьезных заболеваний у людей, экспериментальная инфекция является высокопатогенной для предполагаемых видов-хозяев [89].Таким образом, можно было ожидать, что это связано с повышенной способностью регулировать апоптотические ответы в клетках летучих мышей, аналогично тому, что наблюдается с JUNV. К сожалению, однако, экспериментальные ресурсы для углубленных исследований в этих моделях, чтобы определить, играет ли дифференциальная регуляция апоптотического каскада также роль в различных исходах болезней между резервуарными и тупиковыми видами хозяев, в настоящее время отсутствуют.
В целом, эта работа дает нам первое подробное представление о том, как специфические про- и антиапоптотические факторы регулируются во время инфекции TCRV и как они вносят вклад в индуцированный вирусами апоптоз.Кроме того, установлено, что проапоптотические ответы также являются признаком инфекции JUNV, подтверждая модель, в которой активация каспазы для JUNV впоследствии контролируется на поздних этапах апоптотического каскада. Хотя такие исследования роли отдельных белков, содержащих только Bh4, в регуляции апоптоза в контексте конкретной вирусной инфекции остаются редкими, они являются важной предпосылкой для подробных исследований, направленных на раскрытие сложного взаимодействия между различными взаимосвязанными клеточными сигнальными путями, которые затронуты. вирусной инфекцией.Таким образом, модель, созданная на основе этой работы, теперь создает основу для будущих исследований, направленных на выяснение того, как тесно связанные виды аренавирусов с разным патогенным потенциалом регулируют апоптоз, а также связанные пути, и как это влияет на исход инфекции.
Материалы и методы
Ячейки
Клетки Vero76 (CCLV-RIE0228) выращивали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM) с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS), 2 мМ L-глутамина (Q), 100 Ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина ( P / S; Thermo Fisher Scientific) при 37 ° C с 5% CO 2 .
Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) были выделены из цельной крови здоровых анонимных доноров, полученных на коммерческой основе из банка крови больницы Университета Грайфсвальда. Образцы смешивали 1: 1 с PBS и наслаивали на 15 мл среды для разделения лимфоцитов (1,077 г / мл Ficoll-Paque Plus, GE Healthcare). После центрифугирования при 500 × g в течение 45 минут при комнатной температуре (RT) без тормоза слой PBMC осторожно удаляли и снова центрифугировали при 2000 × g в течение 20 минут для выделения клеток.Затем их дважды промывали 15 мл PBS с добавлением 1% FCS с центрифугированием при 200 × g в течение 10 мин перед лизисом хлорида аммония (0,15 M NH 4 Cl, 10 мМ KHCO 3 , 0,1 мМ EDTA. ) в течение 5 мин при комнатной температуре для удаления загрязнения эритроцитами. Промывание 10 мл PBS с добавлением 1% FCS повторяли до тех пор, пока супернатант не стал прозрачным, после чего осадок клеток ресуспендировали в RPMI-1640 с P / S и 2% сывороткой AB человека (Sigma) и высевали в концентрации 3 x 10 6 клеток / лунку в 6-луночные планшеты Primaria (Corning).Клетки инкубировали при 37 ° C с 5% CO 2 в течение 1 часа, чтобы позволить моноцитам прикрепиться, а затем тщательно промывали три раза PBS с добавлением 1% FCS для удаления лимфоцитов. После этого к клеткам добавляли 4 мл RPMI-1640 с P / S и 5% сыворотки AB человека для дальнейшей инкубации при 37 ° C с 5% CO 2 в течение 1 дня перед использованием для заражения и анализа FACS.
Плазмиды
Нокаут генов Bad, Noxa и Puma в клетках Vero76 был достигнут с использованием системы CRISPR / Cas9.Здесь была использована модифицированная версия плазмиды pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 (Addgene # 42230, подарок от Feng Zhang [90]). Эта плазмида экспрессировала направляющую РНК (gRNA), трансактивирующую crRNA (tracrRNA) и нуклеазу Cas9, как в исходной конструкции, но с дополнительной кассетой устойчивости к неомицину для отбора стабильной клеточной линии (pX330-neoR; любезно предоставлено Walter Fuchs, Friedrich-Loeffler-Institut, Германия) [91]. С помощью CRISPOR [92] для каждого гена были сконструированы четыре различных гРНК, после чего соответствующие олигонуклеотиды были отожжены и клонированы индивидуально в pX330-neoR с использованием BbsI.Все конструкции были подтверждены секвенированием по Сэнгеру. Праймеры для гРНК перечислены в таблице S1, а подробные сведения о стратегии клонирования доступны по запросу. Плазмида, кодирующая цитохром c человека с GFP-меткой на N-конце (pGFP-Cytochrome c), была подарком от Дугласа Грина (Addgene # 41181; [93]) и была использована для обнаружения митохондриального высвобождения Cyt c.
Химическая индукция апоптоза и ингибирование p53
Для индукции апоптоза клетки Vero76 инкубировали с камптотецином (CPT; 10 мкМ, Sigma-Aldrich), стауроспорином (STS; 1 мкМ, Abcam) или этопозидом (ET; 25 мкМ, Abcam) в течение 24 часов с использованием указанных конечных концентраций в DMEM.В качестве контроля выполняли обработку тем же количеством ДМСО, которое использовалось для приготовления лекарств (S1 фиг.).
Чтобы установить прямую связь между активацией p53 и повышающей регуляцией нижестоящих мишеней, таких как Puma и Noxa, клетки Vero76 обрабатывали 3, 10 или 30 мкМ пифитрина-α (PFT-α) или ДМСО в качестве контроля. за час до инфицирования TCRV. После заражения применяли среду, содержащую такие же концентрации PFT-α. Обработку обновляли ежедневно, заменяя половину среды свежей средой, содержащей PFT-α, и клетки собирали с 4 точками на дюйм и анализировали вестерн-блоттингом, как описано ниже.
Анализ вирусной инфекции и налета
TCRV (штамм TRVL-11573) или JUNV (штамм Romero) использовали для заражения клеток Vero76 (80-90% конфлюэнтности в 6- или 12-луночных планшетах) или первичных человеческих моноцитов (приготовленных, как описано выше), как указано . Заражение проводили при множественности заражения (MOI) 0,1, 1 или 2, как указано, и оставляли для инкубации в течение 60 мин при 37 ° C с 5% CO 2 . Впоследствии инокулят удаляли, клетки поддерживали в среде DMEM, содержащей 2% FCS и P / S (для клеток Vero76) или RPMI-1640 с добавлением P / S и 5% сыворотки AB человека (для моноцитов человека), и брали пробы от 0 до 4. dpi, как указано в отдельных экспериментах.Затем эти образцы были дополнительно обработаны для вестерн-блоттинга, RT-qPCR, проточной цитометрии или IFA, как описано ниже.
В качестве альтернативы, чтобы оценить рост TCRV в линиях клеток с нокаутом, была проведена процедура инфицирования, описанная выше, и каждые 24 часа отбирались пробы супернатанта для анализа высвобождения потомства вируса методом бляшек. Вкратце, серийные разведения образцов вируса готовили в DMEM без FCS и позволяли инфицировать 80–90% конфлюэнтных клеток Vero76 в 12-луночных планшетах в течение 1 ч при 37 ° C.После этого вирус удаляли и лунки покрывали 0,7% агарозы в минимальной необходимой среде (MEM), содержащей 2% FCS. Планшеты инкубировали в течение 7 дней для образования бляшек перед окрашиванием раствором кристаллического фиолетового (10% формальдегида; 0,1% кристаллического фиолетового).
УФ-инактивированный TCRV использовали в качестве дополнительного контроля и получали путем инактивации соответствующих инфекционных стоков TCRV путем облучения при 254 нм в течение 2 часов с использованием УФ-лампы (RU-VE CHROMA41) [94, 95], после чего проводили полную инактивацию. подтверждено анализом налета, как описано выше.
Антитела
Первичные антитела, полученные от Cell Signaling Technology, были антителами против каспазы 3 (# 9662; 1: 1000/1: 500 [полноразмерные / расщепленные]), каспазы 8 (# 9746; 1: 1000/1: 500 [полноразмерные / расщепленный]), каспаза 9 (# 9508; 1: 1000/1: 500 [полноразмерный / расщепленный]), α-тубулин (# 2144; 1: 1000), Bim (# 2933; 1: 1000), плохой (# 9239; 1: 500), фосфо-Бад (Ser112) (# 5284; 1: 1500), Бак (# 12105; 1: 1000), Noxa (# 14766; 1: 500) и фосфо-p53 (Ser15) (# 9286; 1: 250), а также козьи антитела против IgG кролика, связанные с HRP (# 7074; 1: 5000), и лошадиные антитела против IgG мыши, связанные с HRP (# 7076; 1: 5000).Кроличье антитело против HRP морской свинки было получено от Dianova (DAB-087875; 1: 5000). Антитела против Puma α / β (sc-374223; 1: 1000), Puma α (sc-377015; 1: 500), Bcl-2 (sc-7382; 1: 1000), p53 (sc-47698; 1: 1000 ; IFA — 1: 500), фосфо-p53 (Ser392; 1: 500) (sc-51690), винкулин (sc-73614; 1: 1000) и GAPDH (sc-47724; 1: 2000) были получены от Santa Cruz Биотехнология. Антитело против Bmf (HPA010120; 1: 300) было получено от Sigma-Aldrich. Для подтверждения вирусной инфекции использовали поликлональные антитела против TCRV (1: 1000; IFA — 1: 500) и JUNV (1: 1000) NP (продуцируемые на морских свинках) [39].Конъюгированные с флуорохромом козьи антитела против IgG мыши Alexa Fluor 488 (A-11001; IFA-1: 500) были приобретены у Thermo Fisher, а козьи антитела против IgG морской свинки Alexa Fluor 647 (ab150187; IFA-1: 500) были получены от Abcam. Рабочие разведения указаны для вестерн-блоттинга, если не указано иное.
Вестерн-блот
Клетки собирали в культуральную среду из 6- или 12-луночных планшетов соскабливанием, один раз промывали холодным PBS и лизировали в течение 40 мин на льду в буфере для экстракции клеток (CEB, Invitrogen) с добавлением 1 × cOmplete Protease Inhibitor Cocktail (Sigma- Aldrich) и 1 мМ фенилметилсульфонилфторида (Sigma-Aldrich) с последующим центрифугированием при 18000 xg в течение 10 минут при 4 ° C.Полученные таким образом белковые лизаты затем смешивали с 4-кратным загрузочным буфером геля SDS (10% SDS (мас. / Об.), 40% глицерина (об. / Об.), 20% β-меркаптоэтанола, 0,008% бромфенолового синего, 250 мМ трис-HCl. pH 6,8) и либо нагревали при 95 ° C в течение 5 минут (для образцов BSL-2), либо нагревали дважды при 99 ° C в течение 10 минут (для образцов BSL-4). Образцы разделяли электрофорезом на 12,5% полиакриламидных гелях и переносили на мембраны из поливинилидендифторида (ПВДФ) при постоянном напряжении 15 В в течение 1 ч и 15 мин (Bio-Rad).Блокирование проводили в 10% обезжиренном молоке, приготовленном в трис-буферном физиологическом растворе, содержащем 0,1% Твин-20 (TBS-Tween), в течение 60 минут при комнатной температуре. Первичные антитела инкубировали в течение ночи при 4 ° C, а окрашивание вторичными антителами проводили в течение 60 мин при комнатной температуре. В обоих случаях антитела разводили в 2% обезжиренном молоке в TBS-Tween, как указано. Мембраны тщательно промывали TBS-Tween между всеми инкубациями, за исключением последней стадии промывки, которую проводили без Tween. Сигналы ECL детектировали с помощью Clarity Western Substrate (Bio-Rad) с помощью ChemoCam Imager (Intas) и количественно оценивали с помощью программного обеспечения GelAnalyzer2010.Данные, показанные для каждого белка, получены из одного и того же геля, но для ясности показаны разделенными по условиям обработки.
Проточная цитометрия
Воздействиефосфатидилсерина (PS) на плазматические мембраны определяли с помощью набора Annexin V-FITC (Miltenyi Biotech). Для достижения этой цели обработанные STS, TCRV- и ложно-инфицированные клетки Vero76 собирали трипсинизацией, после чего в соответствии с протоколом производителя проводили окрашивание аннексина V, конъюгированного с флуоресцеинизотиоцианатом (FITC), и пропидиййодидом (PI).Вкратце, клетки промывали 1х буфером для связывания и окрашивали аннексином V-FITC в течение 15 минут с последующей стадией промывки и инкубацией с раствором PI в течение 5 минут, все выполнялись в темноте. Затем без дополнительной промывки происходила окончательная фиксация в течение 10 минут при комнатной температуре в 2% параформальдегиде (PFA) в 1x буфере для связывания, и образцы немедленно измеряли с помощью анализатора MACSQuant Analyzer 10 (Miltenyi Biotech).
После прикрепления человеческих моноцитов к планшетам Primaria была исследована поверхностная экспрессия CD14 для оценки чистоты выделенных клеток.Здесь первичные клетки отделяли с использованием холодного PBS с добавлением 1% FCS и центрифугировали при 300 x g при 4 ° C в течение 10 минут. Затем полученные клетки ресуспендировали в реагенте для блокировки FcR человека (Miltenyi Biotech) в соответствии с протоколом производителя и инкубировали в течение 10 мин при 4 ° C. Затем добавляли человеческое антитело CD14-PE-Vio770 (1:50; Miltenyi Biotech) и инкубировали в темноте на льду еще 15 мин. После еще одного этапа промывки окончательная фиксация происходила в течение 10 минут при комнатной температуре в 2% PFA в PBS с FCS, и образцы были немедленно измерены с помощью MACSQuant Analyzer 10.Данные собирали для 20 000 клеток на образец и оценивали с помощью программного обеспечения MACSQuantify 2.11 (Miltenyi Biotech).
Нуклеофекция
клеток Vero76 трансфицировали электропорацией с использованием 4D-Nucleofector X Unit (Lonza) в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, 1 × 10 6 клеток Vero76 подвергали нуклеофекции всего 5 мкг плазмиды в одной Nucleovette путем добавления раствора Nucleofector и добавки. Использовали рекомендованную программу (DN-100) для клеток Vero, и клетки впоследствии высевали в 25 см флаконы 2 (для трансфекций плазмид CRISPR / Cas9) или 12-луночные планшеты, содержащие покровные стекла (для трансфекции pGFP-цитохром с).
Иммунофлуоресцентный анализ
Как для анализа локализации Cyt c, так и для транслокации p53 клетки Vero76 высевали на покрытые поли-D-лизином (Sigma-Aldrich) покровные стекла микроскопа. В случае локализации Cyt c клетки подвергали нуклеофекции pGFP-цитохромом c перед посевом и инфицированием TCRV, как описано выше. Через 3 дня после заражения клетки инкубировали с 200 нМ MitoTrackerRed CMXRos (Invitrogen) в течение 40 минут при 37 ° C и фиксировали 2% PFA в PBS, содержащем 0.5% FCS при 4 ° C в течение ночи. Блокирование выполняли с помощью PBS, содержащего 10% FCS, при комнатной температуре в течение 2 часов с последующей пермеабилизацией клеток в PBS, содержащем 0,1% Triton X-100, в течение 10 минут. Первичные и вторичные антитела также разводили в PBS, содержащем 10% FCS, и инкубировали в течение 45 минут при комнатной температуре перед тем, как несвязанные антитела удаляли промыванием PBS. Наконец, на покровные стекла наносили ProLong Gold Antifade, содержащий DAPI (Thermo Fisher), и сушили в темноте в течение 24 часов при комнатной температуре. Микроскопию проводили с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа Leica SP5 (объектив 63x), а стопки обрабатывались с помощью программного обеспечения ImageJ версии 1.48 [96].
Количественная ОТ-ПЦР
РНКиз клеток Vero76, инфицированных TCRV и ложно инфицированных, экстрагировали с помощью набора RNeasy Mini (Qiagen), и загрязнение геномной ДНК удаляли с помощью набора TURBO DNA-free (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя. Для двухэтапной RT-qPCR кДНК была синтезирована из 400 нг общей РНК с помощью обратной транскриптазы SuperScript III (Invitrogen), амплифицирована с помощью ПЦР с использованием PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher) и количественно определена с помощью системы AriaMx 96 Real-Time PCR System. и программное обеспечение AriaMx версии 1.3 (Agilent). Все праймеры, использованные в этом исследовании, перечислены в таблице S2 [97–103]. Пороги цикла пробы (Ct) нормализовали с использованием GAPDH, а кратность изменения между инфицированными и неинфицированными клетками рассчитывали с использованием метода 2 -ΔΔCt .
Создание нокаутных клеточных линий с использованием CRISPR / Cas9
Клетки Vero76 подвергали нуклеофекции с помощью конструкций pX330-neoR, экспрессирующих гРНК, нацеленных на Bad, Noxa или Puma, как описано. Затем клеткам давали возможность восстановиться в течение 3 дней, после чего клетки обрабатывали DMEM, содержащей 10% FCS, P / S и 500 мкг / мл Geneticin (G418).Селекцию с G418 продолжали в течение 2–3 недель, при необходимости выполняя пассирование. Затем каждую клеточную линию отбирали клонально и размножали перед исследованием экспрессии Bad, Noxa и Puma с помощью вестерн-блоттинга, как описано выше. Клоны клеток, показывающие полное отсутствие соответствующих белков, были отобраны для использования в последующих экспериментах по заражению TCRV. Кроме того, геномную ДНК из этих выбранных клонов секвенировали для подтверждения введения мутаций в ожидаемые сайты.
Статистический анализ
Количественные данные представляют собой средние значения и стандартные отклонения от нескольких независимых экспериментов, как указано для отдельных анализов. Статистический анализ выполняли с использованием GraphPad Prism версии 8.1.0, при этом различия между группами анализировали с использованием двухфакторного дисперсионного анализа с апостериорными тестами, выполняемыми с использованием теста Сидака (сравнение выбранных пар). Пороговые значения значимости были определены как * p≤0,05; ** p≤0.01; *** p≤0,001; **** p≤0,0001.
06-0541 1062..1069
% PDF-1.5 % 118 0 объект > эндобдж 120 0 объект > поток 2007-03-09T00: 48: 52Z3B2 Total Publishing 6.06b / W2021-03-12T17: 15: 21-08: 002021-03-12T17: 15: 21-08: 00 Acrobat Distiller 4.05 для Windowsapplication / pdf
Механизм индуцированного таурином апоптоза в раковых клетках толстой кишки человека | Acta Biochimica et Biophysica Sinica
Абстрактные
Таурин (Тау) обладает терапевтическим эффектом против рака за счет индукции апоптоза, в то время как основной молекулярный механизм его противоракового действия не совсем понятен.PUMA (модулятор апоптоза с повышенной регуляцией p53) играет важную роль в процессе индукции апоптоза в различных опухолевых клетках человека как p53-зависимым, так и независимым образом. Однако вопрос о том, участвует ли PUMA в процессе индуцированного тау-белка апоптоза раковых клеток, еще не изучен. В настоящем исследовании мы обрабатывали клетки рака прямой кишки человека HT-29 (мутантный p53) и LoVo (p53 дикого типа) с различными концентрациями тау-белка, что привело к подавлению пролиферации клеток и индукции апоптоза в обеих клеточных линиях.Между тем, мы также наблюдали повышенную экспрессию PUMA и высокие отношения Bax / Bcl-2. Чтобы определить роль PUMA в апоптозе, индуцированном тау-белком, мы использовали небольшую интерферирующую РНК-интерференцию для подавления экспрессии PUMA. В результате апоптоз был снижен в ответ на лечение тау-белком. Все эти результаты показали, что PUMA играет решающую роль в пути апоптоза, индуцированного тау-белком, в клетках колоректального рака человека. Демонстрация молекулярного механизма, участвующего в противоопухолевом эффекте тау-белка, может быть полезна при выборе терапевтических мишеней для p53-дефицитного колоректального рака.
Введение
Таурин (тау; 2-аминоэтансульфоновая кислота) впервые был отмечен как незаменимое питательное вещество для кошек в 1975 году [1]. Большое количество исследований и клинических применений продемонстрировало, что тау-тау обладает множеством обширных физиологических эффектов, поэтому он был идентифицирован как эндогенный материал против травм. В последнее время тау-белок используется как жаропонижающее и противовоспалительное средство для лечения заболеваний печени и желчного пузыря [2], сердечно-сосудистых заболеваний [3], диабета [4,5], катаракты [6,7] и так далее.Но его влияние на опухоли ранее не изучалось. Тау может защищать клетки от повреждений, вызванных окислителями, поглощая сильные окислители и цитотоксические агенты [8], поэтому тау как эффективный антиоксидант может препятствовать увеличению количества активных форм кислорода (АФК) в опухолях, что приводит к задержке развития рак [9]. Кроме того, тау-белок может играть роль в противоопухолевом процессе, подавляя MMP-2, повышая регуляцию N -ацетилгалактозаминилтрансферазы и тем временем подавляя потенциальную инвазию и метастазирование, вызванное ионизирующим излучением [10].
Апоптоз, также известный как запрограммированная гибель клеток, представляет собой автономную гибель клеток, основанную на генетической программе. Члены семейства Bcl-2 проявляют свои эффекты через путь митохондриального апоптоза, который играет ключевую роль в путях апоптоза. До сих пор члены семейства Bcl-2 можно разделить на антиапоптотические (включая Bcl-2, Bcl-xL) и проапоптотические подмножества (включая Bax, Bak, Bid, Bad, Bim и т. Д.) В соответствии с их структуры и функции. Члены семейства Bcl-2 обладают гомологией в 1–4 консервативных областях, которые обозначены как домены гомологии Bcl-2 (BH) Bh2, Bh3, Bh4 и Bh5, соответственно.Среди них домен Bh4 с амфипатической α-спиральной структурой играет важную роль в апоптозе, опосредуя взаимодействие между членами семейства Bcl-2. После того, как клетки подвергаются воздействию апоптотических стимулов, белок Bh4-only и другие регуляторы перемещаются в митохондрии, где они способствуют высвобождению проапоптотических факторов (включая цитохром C, Smac / DIABLO, AIF и эндонуклеазу G) путем изменения митохондрий. проницаемость.
PUMA (модулятор апоптоза с повышенной экспрессией p53), мощный проапоптотический белок, является членом Bh4-only подгруппы белков семейства Bcl-2.После воздействия множества апоптотических стимулов экспрессия внутриклеточной PUMA будет увеличиваться. Домен Bh4 PUMA непосредственно взаимодействовал с антиапоптотическими членами семейства Bcl-2, ингибируя взаимодействие с проапоптотическими молекулами. Таким образом, было высказано предположение, что PUMA является наиболее потенциальным регулятором, запускающим апоптоз [11,12]. PUMA индуцировал апоптоз клеток с помощью следующих трех механизмов: (i) прямое связывание и олигомеризация Bax / Bak, что приводит к конформационным изменениям и митохондриальной транслокации, наконец, изменяя исходный «ген мембранного канала»; (ii) косвенную активацию Bax и / или Bak путем освобождения их от ингибирующего действия антиапоптотического Bcl-2 / Bcl-xL; (iii) связывание с Bcl-xL, которое высвобождает p53 для непосредственной активации Bax.Эти пути увеличивают проницаемость митохондриальной мембраны и высвобождение проапоптотических факторов и, наконец, инициируют апоптоз клеток. PUMA является важным апоптотическим медиатором p53-зависимых и -независимых путей [13] и, как сообщается, имеет потенциальный сайт связывания для p53 в его промоторной области. В p53-зависимом пути апоптоза, в течение нескольких часов после стимулов апоптоза, p53 был задействован в p53-чувствительном элементе, и, кроме того, были индуцированы транскрипция и трансляция PUMA [14,15].Между тем, PUMA может индуцироваться другими регуляторами независимо от р53, такими как глюкокортикоиды [16], фактор транскрипции E2F1 [17] и киназа c-Jun [18]. Несколько исследований показали, что PUMA играет важную роль в опухолях [19], гипоксии сосудов головного мозга и миокарде, реоксигенации [20,21] и клеточном апоптозе нескольких клеточных линий. Следовательно, PUMA может быть эффективной мишенью для лечения рака.
В настоящем исследовании мы обрабатывали клетки колоректального рака человека HT-29 и LoVo с помощью тау-белка, что привело к подавлению пролиферации клеток и индукции апоптоза в обеих клеточных линиях.Результаты показали, что PUMA играет решающую роль в пути апоптоза, индуцированного тау-белком в клетках колоректального рака человека, и тау-белок может быть полезен при выборе терапевтических мишеней для p53-дефицитного колоректального рака.
Материалы и методы
Реактивы и антитела
Тау был приобретен у Sigma (Сент-Луис, США). Среда RPMI-1640, среда Игла, модифицированная Дульбекко (DMEM), и фетальная бычья сыворотка были приобретены у Gibco (Гейтерсбург, США).Набор для обратной транскрипции кДНК был приобретен в Thermo Scientific (Уолтем, США). Поликлональное антитело против GAPDH (TA-08), моноклональное антитело против Bcl-2 (sc-783) и моноклональное антитело против Bax (sc-526) были приобретены в Санта-Круз (Санта-Круз, США). Поликлональные антитела против PUMA (# Q9BXh2-4976) были приобретены в Cell Signaling Technology (Беверли, США). Конъюгированные с пероксидазой хрена (HRP) козьи антимышиные IgG (ZDR-5307) и козьи антикроличьи IgG (ZDR-5306) были приобретены в Beijing ZSGB-Bio Company (Пекин, Китай).
Клеточные линии и животные
Клетки рака толстой кишки человека LoVo (p53 + / + ), эпителиальные клетки почек человека 293T и клетки рака толстой кишки человека HT-29 (p53 — / — ) были получены из банка клеток коллекции типовых культур Китайской академии. наук (Шанхай, Китай) и культивировали в среде DMEM и RPMI-1640, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, соответственно. Все клеточные линии поддерживали при 37 ° C с 5% CO 2 . Бестактные мыши без патогенов, специфические для самок (BALB / C) (сертификат No.HNASLKJ20121369), возрастом 4 недели, были приобретены у Hunan Slack King of Laboratory Animal (Чанша, Китай) и содержались в шкафу с ламинарным потоком (Su net Aetna, Сучжоу, Китай) на факультете зоотехники Наньчанского университета при постоянной температуре. , постоянная влажность и стерильная среда.
Медикаментозное лечение
Все клеточные линии обрабатывали градиентом концентрации тау-белка (10–160 мМ, растворенного в среде без фетальной бычьей сыворотки) в течение различных периодов времени.Клетки, обработанные 4 мкг / мл цисплатина (DDP), использовали в качестве положительного контроля.
Анализ пролиферации клеток
Рост клеток определяли с помощью анализа 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолийбромида (МТТ) Sigma (Сент-Луис, США). Вкратце, 5000-8000 клеток на лунку высевали в 96-луночный культуральный планшет в четырех повторностях для каждой группы. После инкубации в течение ночи клетки обрабатывали различными концентрациями тау-белка (10–160 мМ) и инкубировали в течение 24, 48 и 72 часов соответственно.Реагент МТТ [20] добавляли в каждую лунку в концентрации 5 мг / мл, и смесь инкубировали еще 4 часа. Кристаллы формазана, образованные жизнеспособными клетками, затем растворяли в 150 мкл диметилсульфоксида и значения оптической плотности измеряли при 490 нм. Степень ингибирования рассчитывалась следующим образом:$$ \ eqalign {& \ hbox {Inhibition} \; \ hbox {rate} (\%) = (1 — \ hbox {абсорбция} \; \ hbox {of} \; \ hbox {эксперимент} \; \ hbox {эксперимент} \; \ cr & \ qquad \ qquad \ hbox {group} / \ hbox {абсорбция} \; \ hbox {of} \; \ hbox {} \; \ hbox { control} \; \ hbox {group}) \ times 100 \%} $$
Анализ проточной цитометрии
Апоптоз анализировали путем обнаружения экстернализации фосфатидилсерина с помощью проточной цитометрии.Использовали двухцветный анализ с использованием двойного окрашивания аннексином V / PI, меченным флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) (набор Annexin V-FITC / PI был продуктом Nanjing Key-GEN BioTECH Co., Нанкин, Китай). После обработки тау-белка в течение 48 ч собирали 1–5 × 10 5 клеток, суспендировали в 500 мкл связывающего буфера и инкубировали с FITC-меченным аннексином V (BioLegend, Сан-Диего, США) и йодидом пропидия (PI) для 15 мин в темноте при комнатной температуре. Затем апоптоз анализировали с помощью сортировки клеток, активируемой флуоресценцией (Becton Dickinson, Franklin Lakes, США).
Hoechst 33342 окрашивание
Клеточную суспензию высевали в 12-луночный планшет из расчета 1 × 10 5 клеток на лунку. На следующий день клетки обрабатывали 80 мМ тау-белка в течение 48 часов. Всего 500 мкл Hoechst 33342 (Beyotime, Хаймен, Китай) добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение 20–30 мин при 37 ° C в темноте. Наконец, несвязанный краситель удаляли и морфологию апоптотических клеток наблюдали с помощью флуоресцентного микроскопа (Olympus, Токио, Япония).
Анализ полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией
Тотальную РНК обычно экстрагировали с использованием Trizol (Invitrogen, Carlsbad, USA). Концентрацию и чистоту РНК измеряли с помощью измерителя для количественного определения нуклеиновых кислот Eppendorf. Затем целостность РНК наблюдали после гель-электрофореза. GAPDH использовался в качестве внутреннего контроля. Уровни экспрессии PUMA , Bax и Bcl-2 определяли с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР).Праймеры для PUMA , Bax , Bcl-2 и GAPDH перечислены в таблице 1 . Продукты амплификации ПЦР анализировали электрофорезом в 1,5% агарозном геле. Изображения геля были сделаны для анализа шкалы серого ремешка. Были обнаружены значения оптической плотности (OD) генов-мишеней и соответствующих продуктов GAPDH в каждой группе. Статистически проанализировано соотношение между целевым геном и GAPDH .
Таблица 1.Последовательности праймеров для ОТ-ПЦР
| Ген . | Последовательность праймера (F / R) . | Длина изделия (п.н.) . | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| ПУМА | 5′-CCTCAGCCCTCGCTCTCGC-3 ‘/ 5′-CCGATGCTGAGTCCATCAGC-3′ | 559 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 5′-AGGCACCCAGGGTGATGCAA-3 ‘ | 304 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Bax | 5′-TTGCTTCAGGGTTTCATCCA-3′ / 5′-CAGCCTTGAGCACCAGTTTG 5′-CAGCCTTGAGCACCAGT8367 9037 9037 9037 9037 9037 9037 9037 9037 9037 9037 9037 9037 9037 9037 9037 9037 GGCTCTCCAGAACATCAT-3 ‘/ 5′-CACCTGGTGCTCAGTGTA-3′ | 241 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| GAPDH | 5′-TCACCATCTTCCAGGAGCGAG-3 ‘-07 907 907 907 TGACTCCAGGTCGAG-3’ / 907 907 907 907 907 907 907 907 907 907 907 907 907 907 908 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Ген . | Последовательность праймера (F / R) . | Длина изделия (п.н.) . | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| ПУМА | 5′-CCTCAGCCCTCGCTCTCGC-3 ‘/ 5′-CCGATGCTGAGTCCATCAGC-3′ | 559 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 5′-AGGCACCCAGGGTGATGCAA-3 ‘ | 304 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Bax | 5′-TTGCTTCAGGGTTTCATCCA-3′ / 5′-CAGCCTTGAGCACCAGTTTG 5′-CAGCCTTGAGCACCAGT8367 9037 9037 9037 9037 9037 9037 9037 9037 9037 9037 9037 9037 9037 9037 GGCTCTCCAGAACATCAT-3 ‘/ 5′-CACCTGGTGCTCAGTGTA-3′ | 241 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| GAPDH | 5′-TCACCATCTTCCAGGAGCGAG-3′-907 907 907 TGATCCAGGAGTCGAG-3 ‘-907 907 907 TGATTCCAGGAGCGAG-3’ / 907 . Последовательности праймеров для ОТ-ПЦР
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||